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各位前辈,大家好!我是初学者,最近做了几次PCR,先用正常的细胞提出来的RNA摸条件,结果上次用的是55度退火,目的带和内参都很亮,但其下也有一片模糊的背景,后来我大批量的做了一次条件没变,结果内参还行,目的带根本没有,不过后来的这次我把体系减半了,原来PCR是40微升的体系,这次减为20微升了,引物各加的0.25微升,是不是我的引物太少了?另外我买的是TAKARA的两步法试剂盒说明书上RT是10微升体系而PCR是40微升体系是不是太多了,而且说第二步是把PCR反应液加到RT产物里这样跟一步法基本上不就一样了吗?还有就是我的片断才一百多个bp,条件该怎么设啊?既然上次出结果了是不是就可以排除引物的问题了?急盼各位指点迷津,谢谢!!!