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标题:【求助】不用RNaseH处理，反转录后的cDNA是杂交双链还是单链

王薇薇安[使用道具]
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发表于 2016-1-6 15:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】不用RNaseH处理，反转录后的cDNA是杂交双链还是单链


反转录时，不用RNaseH处理，仅做First strand cDNA的合成。我认为在理论上这时的cDNA是和mRNA杂交的，对吗？
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王薇薇安[使用道具]
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发表于 2016-1-6 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这时不进行DNA第二链的合成，直接做PCR能出结果吗？
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kuaizige[使用道具]
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发表于 2016-1-7 10:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以，有RNase H阴性的逆转录酶，还不一样用么？为什么？看温度吧！
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kuaizige[使用道具]
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发表于 2016-1-7 10:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

RT只是第一链的合成，之后直接进行下一步pcr,你的两条引物中，必定有一条会去结合1st strand.
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yayya[使用道具]
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发表于 2016-1-7 10:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该是单链吧，因为逆转录酶具有RNAaseH的活性，可以水解cDNA中的RNA链。
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王薇薇安[使用道具]
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发表于 2016-1-7 10:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

前几天Fermentas公司技术回邮件说：如果使用M-MLV，则RNaseH活性较低，这时形成的是杂合双链和cDNA单链的混合物。
大家的解答都对，重点不同。
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seagate[使用道具]
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发表于 2016-1-7 10:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那不用到底会不会影响pcr?
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王薇薇安[使用道具]
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发表于 2016-1-7 10:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

RNaseH是降解杂合双链中的RNA链的。做cDNA文库需要，只做RT-PCR不用太在意。
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65urh[使用道具]
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发表于 2016-1-7 10:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那不用到底会不会影响pcr?

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不会的，前面有人已经解释过了，PCR的时候至少有一头的引物会配对上去，完成一链的扩增，而另一链就会依次以现有的模板继续扩增。而原始的cDNA不管有没有杂合的RNA配对双链的存在都没关系，因为PCR程序里面都有个退火的过程，cDNA会变成单链的。
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