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标题:【求助】高GC含量PCR困难，求助

caihong[使用道具]
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发表于 2016-1-7 10:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

重新设计引物。可以提高退火温度， 96 5m 95 45s.
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okhaha[使用道具]
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发表于 2016-1-7 10:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我们目的基因有相似之处，同样用的LATAK带GC buffer。我帮回答你的提问。所以加dNTP，4ul是按照说明书上推荐的，不知道对不对，请指正。
请问你两个问题：1，不知你为何只加1ul dNTP，是25ul体系中吗，效果如何？ 2，你所采用的方法是在以前20循环产物为摸板，再从新批吗？如果是稀释吗？重复性好吗？不知能否贴上你的体系，大家共同学习！！！
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发表于 2016-1-7 10:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢诸位的热诚帮助，这几天加了点DMSO试试，结果效果不明显。楼上同道提出的4uldNTP问题，正如“贵在坚持”所答，按照说明书上推荐，当然我想楼上所言有道理的，LA Taq可能考虑需要扩长片段，因此dNTP推荐量比较充足，而我的片段较短，也许4ul有些浪费了，呵呵！
此外，这几天仍间有扩出，成功率有所提高（与DMSO无关），条件、体系未变。其中一次因LA Taq用完，用普通酶扩3个标本，其中有1个成功。不过如此速度不知要何时结束。我想既然在此体系、条件间有成功，那么是否能说明我的条件、体系没有问题？
是模版的问题？但有的模版第一次扩不出，第二次能扩出。有时同时扩5个模版，一个也不成功。而已扩出的模版也未必第二次能扩出。
是PCR仪器加样孔的问题？虽然仪器有的孔可能有问题，但我现在一般都放在已扩成功的孔上再扩的。
是我加样技术有问题？经多次重复操作，我想还是比较正规、熟练的。而且也请其他同事操作过，也未成功。
另外请教，为何想到用PCR产物再P,这与多几个循环有何区别。
请各位帮助分析原因，提供建议，接下来我准备降低退火温度再试试。我想集思广议，总有方法能解决问题的！
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发表于 2016-1-7 10:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
其实重点只有一个：马上用GC buffer！
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seagate[使用道具]
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发表于 2016-1-7 10:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好，我用的就是TAKALA的2.5mM的dNTP，25ul体系中只加1ul，PCR产物产量很高，我一直都是这样用的。
2GC buffer I  12.5
dNTPs   1
10umol/L 引物  1/ 1
模板   1
LA Taq (5U/l)  0.3l
加 ddH2O 至  25l
反应条件：
96℃ 2min
98℃ 10sec，70℃ 5min，20cycles
72℃ 10min
一扩产量低时，可以将一扩产物稀释后做模板进行2扩，我做的时候是将一扩稀释10倍后，再取1ul做模板，二扩也选择20个循环。其实此法更适合以cDNA为模板扩增那些表达量低的基因的ORF
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ujne[使用道具]
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发表于 2016-1-7 10:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，刚看到你的问题。不知道你现在是否已经解决了上述问题？
因为对你的具体实验不太了解，所以只能谈谈我的想法，不知道对你能否有帮助。第一，不能排除你模板的问题，因为你做的是多态，所以扩出和未扩出的模板一定是不同的，所以你应该首先验证你的模板质量，一般来说应该选择一个管家基因如actin,GADPH做内对照，如果扩出内对照而你的目的片段未出，则证明是模板的问题。做多态设一内对照是必须的。第二，引物的特异性，因为不知道你的多态是哪一种，所以不知道是不是涉及到引物了，如果没有，是不是引物能形成二聚体或内部的茎环而影响扩增？第三，PCR做的MIX是否充分混匀，这点很重要，一定是要先离心，再涡旋再离心，然后均分到各管中。另外你的移液器是否精确，也会影响到实验结果。
2005-06-09 18:56
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发表于 2016-1-7 10:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

第四，二次PCR的优点是避免了一次PCR循环数过多而造成taq酶的失活，所以效率更高。不过看你的实验好像是有和没有的问题，估计对你不太适用。第5，反应条件中变性温度提高到98度试试，因为基因组DNA难打开，用高温较合适。
此外，你还要考虑到是否模板溶的不好，这样每次吸上来的模板质量就不同。PCR仪的问题估计不大。祝你好运
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发表于 2016-1-7 10:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好！看到你的体系和条件，感觉有些疑惑，因为我对pcr不精通，现在郁闷的扩增中，所以请你理解我的一再追问并且不吝赐教，在此感谢了！
1，如果我没有搞错，LA Taq需要相对较高浓度的mg， GC buffer I里的mg高含量正适应了这需求，高mg必然要求高的dNTPs，1ul够吗？
2，两步法适宜于引物退火温度较高，接近70的情况，你的引物退火温度设计的很高吗？是依据软件得到的，还是4（G+C）+2（A+T）公式算出吗？我的目的基因与另一基因同源性高达99%，所以设计的引物不可避免会扩增出非目的带，两步法也可以采用吗？
3， 利用pcr产物作摸板，可能会使突变的发生率增高，你的实验过程中有这样的情况吗？
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发表于 2016-1-7 10:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1、我觉得你可以根据自己的模板、引物、反应体系来适当调节DNTP的量。我用1ul是很成功的。其间也有师弟用2.5UL扩的也不错，后来我告诉他试试1ul，结果他也扩的很好。你可以试试，4ul也未尝补可，就是有点浪费了。
2、因为我的引物GC含量都很高，我是用GENERUUNOR软件来分析的，结果显示退火温度都超过85度。引物合成回来后我主要参照合成单上的引物退火温度来摸适宜的退火温度。当然，这个条件也摸索了很长时间，touchdown也试过，效果不好。双温我最低做过65度，效果也不错。我不知道你PCR的目的是什么，如果只是想得到目的片段，那有非特异带也无所谓，跑胶后你可以把目的带切下来，回收纯化，再以纯化产物做模板再扩，效果也不错，我师弟就是用这种方法做的表达连接。
3÷二扩确实存在这个问题，但是，这要根据你实验的具体要求来定，如果做连接，测序就可以排除突变，并总会找到未突变的片段。你可以把你的实验具体讲讲，我再帮你分析一下，OK?
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bhka[使用道具]
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发表于 2016-1-7 10:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是我昨天看到你的帖子就不会用你的条件试一次了,没想到你的引物退火温度如此高,怪不得嫁接过来没结果。
我的目的就是为了得到目的基因，我正在准备回收酶切连接，可是我必须为连不上做准备，所以必须将pcr条件尽量优化。
说道引物退火温度，我就我的引物问过数位高手，相互之间的计算方法都不太一样，都给我说这只是估计，关键是自己摸，圆内对如何计算退火也没有统一的意见，所以我觉得pcr没有一个相对模式化的方案，非常不好。我也曾给本版高手eeflying发过信，第一封回了，让我把目的基因和引物发过去，我发了两次，以后就没有音讯了。
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