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你的基因序列和引物序列我已看过.基因全长ORF只有460多个碱基,而且GC含量将近60%也不算太高,因此感觉上不应该太难扩.你的引物我是在gene ruuner里看了一下,虽然引物内部能够形成二级结构,但是也不能说这对引物不好.一般说来3`端的二级结构挺讨厌的.我的师妹也遇到和你一样的问题,cDNA和引物都找不到问题就是扩不出来,后来没办法就换题了.
另外我觉得你的引物最低的退火温度也应该在60度左右.你在52度扩出来的目的带很可能也是非特异带,我那个师妹就是这样,根据引物序列和合成单上给的退火温度,至少应该65度退火,可是她只在56度有带,当然还有很多非特异带,跑胶回收去测序,结果不是,建议你也可以先测序验证一下.
还有,你要确认一下在你提RNA的组织中这个基因是不是高表达的,如果表达量很少,那你成功的机会就低.祝顺利
