【求助】请教目的基因多少bp - 经验共享

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标题:【求助】请教目的基因多少bp

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发表于 2016-1-7 10:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

参考各位的意见，今天进行了退火温度的摸索：
94度 5min
94度 45s
**度 30s
72度 1min
共32循环
72度延伸10min
目的基因1：TM为58度，退火温度摸索：52、54、58、60
目的基因2：TM为64度，摸索温度：58、60、62、64
目的基因3：TM为57.8度，退火温度摸索：52、54、58、60
加样：
cDNA稀释2倍后，加样4ul
dNTP加4ul(*2.5mM)
按50ul体系加样后，平分4管进行PCR（为了省样本和试剂，一个师姐教的方法），即：12.5ul，加上12.5ul石蜡油，Ependorf 的PCR仪器（有热盖功能），循环设置如上所列。
电泳：25ml的琼脂，90V电泳约30min
附图注释：从MARKER(每100bp为一亮带)数起，每四条带对应目的基因1、2、3
头四条带（目的基因1）似乎见到条带，却不是我要的（目的位置为436bp)
中间4带（目的基因2），似乎是所谓的非特异性条带（目的位置应该是252bp），拖尾非常严重（同前相比，连MARKER也似乎拖尾了，琼脂糖问题？我用的是1.5％的浓度）
右边4带（目的基因3），什么都没有（我要的是643bp的条带）
恳请各位给个看法和判断，那些方面还可以改进的
万分感谢！

附件

2016-1-7 10:54

39402397.jpg (10.06 KB)

泡泡[使用道具]
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发表于 2016-1-7 10:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

看了你的电泳图,说下我的个人见解:
1.基本上除了1~4道似乎还能看到点像是目的基因1.目的基因2和3算是完全没有扩出来.杂带太多或者是根本就没有带.
2.现在目的基因1和2的退火温度已经摸了52~60度,看来P的效果也很不好.那么再尝试下到64度.如果还不出结果的话.考虑下是不是引物的问题.你的Mg2+是单加的还是和Buffer混合在一起的?试着调调Mg2+浓度,不过估计不会有太大改观.
3.目的基因3的TM值比较高,在64度,没有扩增出,甚至杂带.那么我建议你再提高到72度.也就是可以将退火和延伸温度都设置为72度.如果还是没有任何条带.考虑问题同上.
4.你的基因片段数都在500bp左右,建议用2.0%的琼脂胶.电泳的时候先设置低电压3V/cm,待产物出孔一段后再设置较高电压5V/cm.电泳液没过胶1~2mm即可.
5.加样的顺序为:无酶双蒸水,10*Buffer,dNTP,Mg2+,引物A,引物B.模板,Taq酶.不知道你是不是这样加的.
6.退火温度时间建议延长到45S.引物与模板结合时间可能过短,尤其是目的基因3.延伸温度建议45S足够了.目的基因3的循环数还可以调到36个看看.
7.PCR的样本可以加到模板后再分装到PCR管中,这样既节省Tip头也能保证各PCR管中试剂均一,既在一个0.5ml的EP管中把4管的试剂依次加好(4倍加入),然后分装,最后加酶.一点点小经验.可以试试.
有了热盖.为什么还加石蜡油呢?为了节省cDNA,那个方法倒是可以.不过P的时候需要设置体系数目为25ul.体系越小,PCR仪对温度的调节越不好控制.所以如果模板多的话,最好还是用标准体系.
希望还有其他热心战友为ctyw708帮忙分析.谢谢.

泡泡[使用道具]
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发表于 2016-1-7 10:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的分析很详细，谢谢！
补充几点：
1、Mg2+是Buffer自带的，浓度未知
2、加样顺序，说明书提供如下：
1－5ul firsr strand cDNA
5ul 10×PCR Buffer
1ul dNTP MIX (10mM)
2ul 25uM Primer Forward(自备)
2ul 25uM Primer Reverse(自备)
**ul水（使总体积为49ul)
1ul Taq DNA polymerase
与您所说的不同，不知可否（内参这样做，似乎没有问题，条带图见上面帖子）
3、我加的水是高压时间比较久的了，估计达不到无酶，甚至无菌也不敢保证，是否会有影响？
4、引物事北京三博远志合成的，质量不知如何（内参还可以）
5、所有引物都是参考国外同一篇文献，选择理由：引物条件和位置说明的都很详细
是否太轻率
自己不会用Blast，很被动啊
6、我的PCR设置Tube 是0.2ml ,体系数目竟然设为13ul! 而不是您说的25ul！天哪l
呜呜......

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发表于 2016-1-7 10:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

2ul 25uM Primer Forward(自备)
2ul 25uM Primer Reverse(自备)
**ul水（使总体积为49ul)
你的引物加的过量了.
一般在50ul的体系里,引物终浓度是400nM.
即引物的物质的量为20pmol.(一般10pmol~20pmol)
所以是20uM的Primer加1ul即可.
你的超过了一倍多.呵呵
修改为:
1ul 20uM Primer Forward(自备)
1ul 20uM Primer Reverse(自备)
**ul水（使总体积为49ul)

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发表于 2016-1-7 11:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先声明我是菜鸟，我做的时候用的是HiFiMix，高保真的，效果挺好的，觉得如果楼主资金充足，不如买个用用，总比这样摸索来的舒服，还节省时间，节省样品。个人愚见。

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发表于 2016-1-7 11:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

参考了大家的意见，今天再次PCR
目的基因1：TM为58度，退火温度摸索：58、60、62、64
目的基因2：TM为57.8度，退火温度摸索：58、60、62、64
1、三蒸水重新高压
2、引物重新配制，改为20mM,加样1ul
3、cDNA按1：2稀释后，加稀释液3ul
4、退火温度见上，时间延长为45s
5、72度延伸时间缩短至45s
6、循环数目增加到36cycles
7、加样顺序依然为：cDNA, pcr buffer, dNTP, primer 1 ang primer 2 ,水
最后加Taq酶
体系为50ul,最后平分为4管，即12.5ul，加入12.5ul 石蜡油
8、体系数目更改为25ul
9、琼脂糖浓度为2.0％，90V 30min
如图，似乎什么都没有了
个人觉得原因：
1、条件不对
2、引物特异性问题
3、引物质量问题（除外内参）
4、没有目的基因表达
各位大侠，还有什么可以指教的么？
谢谢！（目的基因1、2从左到右，各跑4条带）

附件

2016-1-7 11:07

62017894.jpg (3.4 KB)

moonlight[使用道具]
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发表于 2016-1-7 11:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

图不太清楚
不过看上去是没什么东西.
由于不在现场,我建议你试试其他人的PCR体系,仅用你的cDNA和引物(可以排除下你的体系问题).或换贵一点的酶,比如Taq-plus.(Taq+puf)
还有就是如果你的模板(样本)比较珍贵,那么可以先提取有你需要的目的基因表达的其它组织(细胞)做.条件摸好了再用你的样本做.到时候只需要调整模板量就可以了
多查文献,找找是否有别人做过,到底表达吗?还是低表达?或者有没有人做你的目的基因的Western.若有Western结果,那么一定有表达的.
引物可以尝试换家合成公司(生工),或者新设计.
你的条件做的也比较多了,再做可能会有“PCR是魔鬼！”的感觉.
多查资料吧,会找到原因的.

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