【求助】反向PCR

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标题:【求助】反向PCR

ilovegaga[使用道具]
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发表于 2016-1-7 11:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

下面是关于反向PCR的介绍：
反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，因此又称为染色体步移。这时选择的引物虽然与核心DNA两末端序列互补，但引物3’端是相互反向的。
反向PCR的操作流程：扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段。
我对这句话：“这时选择的引物虽然与核心DNA两末端序列互补，但引物3’端是相互反向的。” 百思不得其解！
请大家多多指教！！
谢谢！

misswu61[使用道具]
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发表于 2016-1-7 11:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

.......5'xxxxxxxxxxxxxxxxxATGCATGGGGG(引物1)NNNNa|bNNNNNCCCCCCCCCC（引物2）xxxxxxxxxxxxxxxx3'......................
上面这个序列，xxxx代表未知序列，atgc以及a,b, N代表已知序列。|代表酶切位点。
你的目标是引物1上游的未知序列。
这个时候：
5'xxxxxxxxxxxxxxxNNNNNNNNNNNNNNa|bNNNNNNNNNNNNNNNxxxxxxxxxxxxxxxx3'
酶切，a,b两个片段均反转过来，连接，就可能出现
5'aNNNNNNNxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx|xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxNNNNNNNNNNNNNb3'这样的分子，
这就是你反向PCR的靶分子。
在纸上画画这个过程，你就明白了。

xuuuu[使用道具]
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发表于 2016-1-7 11:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这里简单说，扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子，这个时候，扩增目的片段在环状分子内侧（环的下面），而已知序列在环状分子上段，这个时候设计的引物其3‘端是向环的下面——即相对已知序列是反向的，也就是未知序列的方向。建议你画个草图来试试。

huifeng0516[使用道具]
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发表于 2016-1-7 11:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

一个转贴的图，希望有帮助

附件

2016-1-7 11:30

53722170.jpg (19.13 KB)

ilovegaga[使用道具]
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发表于 2016-1-7 11:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问酶切后再连接的产物你是不是把5‘和3’端标反了？另外引物跑到哪里去了？

ilovegaga[使用道具]
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发表于 2016-1-7 11:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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发表于 2016-1-7 11:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，因此又称为染色体步移。这时选择的引物虽然与核心DNA两末端序列互补，但引物3’端是相互反向的。
反向PCR的操作流程：扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段。
我对这句话：“这时选择的引物虽然与核心DNA两末端序列互补，但引物3’端是相互反向的。” 百思不得其解！
——————————————————————————
但引物3’端是相互反向的。” 百思不得其解！
但引物3’端是相互反向的。” 百思不得其解！
但引物3’端是相互反向的。” 百思不得其解！
我主要是不理解这里，请大家多费心吧！谢谢大家！

ilovegaga[使用道具]
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发表于 2016-1-7 11:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你说的意思是好像是在直线分子中设计出的引物并不是能使两个引物之间的已知序列得到扩增，而是把引物设计成反方向，对么？
我是结合楼上的图理解的。请你也看看楼上的图。那两个引物在直线分子中所引起的DNA复制应该按照5‘到3’的方向，所以在线形DNA里面引物间的片段不会得到扩增；只有连接成环状了，才会先扩增得到unknown区，再得到known区。
对么？
可是我在楼上提出的问题中的那句话“ 这时选择的引物虽然与核心DNA两末端序列互补，但引物3’端是相互反向的。”到底该怎么理解呢？
谢谢大家，大家还得受累了！！

woshi[使用道具]
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发表于 2016-1-7 11:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位大侠：
我想做用同源重组方法构建一病毒的缺失株，但是该病毒的分子背景很不清楚，我现在只知目的基因短短的约1kb的片断，而其两侧的序列完全未知。我的问题是用反向pcr能否用来扩增我要构建的同源质粒的两臂？按相关文献介绍，两臂一个要1kb以上，另一个常为4-6kb，用反向pcr能扩增到这么长的片断吗？

woshi[使用道具]
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发表于 2016-1-7 11:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问反向PCR是用来将仅知部分序列的全长cDNA进行分子克隆，还是可以扩增全长CDNA之外的未知序列，按照反向PCR的原理，似乎是可以扩增全长CDNA之外的未知序列的对吗？如果那样我且不是可以扩增我想要的已知序列两侧的任何长度的片断了吗？切盼各位的指教，多谢先。

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