小中大【求助】实时荧光定量PCR仪引物设计
各位大侠好：
小女子初次涉猎实时荧光定量PCR的实验，实验室里目前没有人自己设计引物，所以只好。。。准备采用SYBR Green 法实验。之前也看了很多资料，大致了解了引物设计的原则。但是设计中出现很多我弄不明白的问题和设计出来的引物我不知道能否使用。我想现在把自己的设计步骤写下来，请各位帮忙，看看哪里有问题的。
首先，我在NCBI中查到目标蛋白的mRNA。
然后，将其放入Beacon Designer8.0中，按照软件的default value设置设计出6对引物。引物得分都在90分以上，最高92.9分的有两对，基本都在同一位点，引物5‘和3’都在1000多bp处。这样设计出的引物可靠吗？
接着，将引物序列放入NCBI的primer Blast中，在PCR template中输入目标蛋白的NM号，然后再Primer parameter中输入软件设计的得分最高的引物，在Organism中选小鼠，在database中选refseq RNA，其他设置不变，得到了
Products on intended target是我想要的产物 82bp，但是在Products on potentially unintended templates中也有很多产物，但都在100bp以上，最小105bp，最大2000多bp。如果我采用这对引物，这些Products on potentially unintended templates会影响我的实验结果吗？利用熔解曲线可以区别吗？这是我的blast结果吗？
另外，我想问问文章里的real-time PCR的引物可以用吗? 我用相同blast方法查了，有些产物也分intended 和unitended。还有的引物之间有配对现象，不知道还能否使用？ 文献中利用Taqman法的引物能不能用于SYBR呢？
以上就是我的操作过程，很多的地方我都是一知半解，不是很懂。写出来的问题是我最不明白的。恳请各位大侠能够帮我解决问题。
