【求助】PCR结果分析

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标题:【求助】PCR结果分析

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发表于 2016-1-7 16:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最近在做普通的PCR，内参GAPDH可以做出来，但换做我自己的目的引物，并摸温度梯度（50-60摄氏度）时却无结果。第一张图是GAPDH的结果。第二张是目的的结果，图中的引物二聚体还是什么呢？请高手给以我指点下！！

附件

2016-1-7 16:32

53910760.jpg (5.83 KB)

2016-1-7 16:32

27885960.jpg (8.44 KB)

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发表于 2016-1-7 16:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

第二张图是我做50-60度温度梯度的PCR结果，上样量为8ul（以前用5ul没有跑出条带，所以增加上样量）这张是以前跑的加5ul PCR产物的上样量

附件

2016-1-7 16:35

78372257.jpg (7.06 KB)

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发表于 2016-1-7 16:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

第二张图是没有加marker的，因此就用同一次的PCR产物5ul上样，跑出的结果图，忘记说了，我的PCR产物应该是130bp的，marker最小是150bp

附件

2016-1-7 16:37

93035341.jpg (4.96 KB)

Darcy[使用道具]
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发表于 2016-1-7 16:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

看第二张图，你的电泳没加MARKER，虽说在最小的地方有条带，也不能说就是你130bp的目的条带（你的目的条带太小），不过我看着应该是引物二聚体。

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发表于 2016-1-7 16:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 Darcy 于 2016-1-7 16:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

看第二张图，你的电泳没加MARKER，虽说在最小的地方有条带，也不能说就是你130bp的目的条带（你的目的条带太小），不过我看着应该是引物二聚体。

第四张图用的PCR产物跟第二张图用的PCR产物是同一次扩增的产物，第四张图跟了marker的，可以看到模糊的条带，很宽很弥散，并且位于marker的最低位置（150bp）和marker的第二个条带（300bp）之间。如果是引物二聚体的话，是不是应该没有这么大吧？

loli[使用道具]
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发表于 2016-1-7 16:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的marker怎么这么模糊，能拍的更清楚些么，marker的亮度应该跟你第一张图片的亮度差不多才对吧

guagua[使用道具]
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发表于 2016-1-7 16:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

第四张图用的PCR产物跟第二张图用的PCR产物是同一次扩增的产物，第四张图跟了marker的，可以看到模糊的条带，很宽很弥散，并且位于marker的最低位置（150bp）和marker的第二个条带（300bp）之间。如果是引物二聚体的话，是不是应该没有这么大吧？

===============================================================================================================

哦，第四张图上除了Marker还有带吗？原来没看出来！你的目的条带是130bp，引物二聚体一般出现在泳道的最前端，那就是杂带。建议你优化下引物用量或者PCR条件试试！

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发表于 2016-1-7 16:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 guagua 于 2016-1-7 16:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
第四张图用的PCR产物跟第二张图用的PCR产物是同一次扩增的产物，第四张图跟了marker的，可以看到模糊的条带，很宽很弥散，并且位于marker的最低位置（150bp）和marker的第二个条带（300bp）之间。如果是引物二聚体的话，是不是应该没有 ...

那我想知道杂带是怎么形成的呢？只听过引物二聚体和非特异性产物。

glass[使用道具]
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发表于 2016-1-7 16:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 969 于 2016-1-7 16:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

那我想知道杂带是怎么形成的呢？只听过引物二聚体和非特异性产物。

我说的杂带就是PCR非特异性产物！
形成原因主要有：第一，引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。第二，Mg2+浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。第三，酶的质量，往往一些酶较容易出现非特异性扩增，酶量过多时也会出现非特异性扩增。
其对策有：1、必要时重新设计引物2、减少酶量或调换另一种酶3、降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。4、适当提高退火温度或采用二步PCR法（93度变性，65度退火与延伸）。
看看的的PCR条件，多试几次，希望能解决你的问题！

969[使用道具]
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发表于 2016-1-7 16:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 glass 于 2016-1-7 16:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我说的杂带就是PCR非特异性产物！
形成原因主要有：第一，引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。第二，Mg2+浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。第三，酶的质量，往往一些酶较容易出现非特异性扩增，酶量过多 ...

哈谢谢你们热情的给我指点迷津，真的非常感谢！我重新订了引物，引物用BLAST搜出来的结果是：特异性较差！

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