小中大我前段时间也在做shuffling，有一点小的心得。不知道你所说的二次pcr是降解产物的二次pcr，还是primerless的二次pcr。降解产物pcr其实弥散的条带是最好的，但是弥散面积的平均大小不能太大，for example，你想最终得到1000bp的条带，那弥散条带的平均大小最好不要大于500bp。primerless的扩出的条带是应该有些弥散的，应该把需要的主条带回收后，以回收产物做模板进行primer再次扩增，如果扩出的条带还是弥散的，那么就是你的bad luck了，建议用降解产物重新premerless。
个人认为如果primerless没有看到弥散的条带，是很不容易最后扩增出目的基因的。不过我有一次“佛山无影脚”却成功了，呵呵，记住是个例！另外，好的运气也是不可缺少的。Good luck！
