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标题:【求助】定量PCR测定DNA中基因拷贝数的一个问题

superboy[使用道具]
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发表于 2016-1-7 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】定量PCR测定DNA中基因拷贝数的一个问题

近来一直在用定量PCR测定小鼠DNA中基因的拷贝数，据某些质粒上显示每套小鼠的基因组DNA大约为3pg左右。我的定量PCR模板量为100ng左右，按照上面的数据推算SRY的拷贝数应该在3×10^4左右，但是我的结果基本上都在10^6左右。是不是书上给出的数据不准呢？
我现在做绝对定量时是将要扩增的目的片段克隆在T载体上，而后用分光光度计测定质粒浓度，按照 浓度×6.02×10^23/质粒分子量的公式来计算标准品拷贝数，这一方法是否正确，请各位指教。谢谢！
我是用TaqMan MGB探针做的定量PCR。
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发表于 2016-1-7 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
近来一直在用定量PCR测定小鼠DNA中基因的拷贝数，据某些质粒上显示每套小鼠的基因组DNA大约为3pg左右。我的定量PCR模板量为100ng左右，按照上面的数据推算SRY的拷贝数应该在3×10^4左右，但是我的结果基本上都在10^6左右。是不是书上给出的数据不准呢？
我现在做绝对定量时是将要扩增的目的片段克隆在T载体上，而后用分光光度计测定质粒浓度，按照 浓度×6.02×10^23/质粒分子量的公式来计算标准品拷贝数，这一方法是否正确，请各位指教。谢谢！
我是用TaqMan MGB探针做的定量PCR。
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发表于 2016-1-7 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

那我做出来的拷贝数怎么会与资料上给出的数据推算出来的差别这么大呢？请指教。
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guagua[使用道具]
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发表于 2016-1-7 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不太明白你说的，但是你的公式没有错，如果需要，检查一些小地方，比如质粒分子
量加没加目的基因，浓度推算是否正确。你的标准曲线是以反应中的决对拷贝数为
X轴，还是浓度即COPIES/UL。很多细小的地方很容易出错的。
再一点，你的模板是GENOME DNA吗？
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superboy[使用道具]
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发表于 2016-1-7 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的机器和主任一样也是RG3000，模板是基因组DNA。我的标准品质粒测定好浓度后用上面的公式将其换算为拷贝数/ul，实验时加入5ul，那么每个点的标准品绝对拷贝数也就知道了。然后再测定样品的浓度，将其稀释到大约20ng/ul，加入5ul。测出的就应该是100ng DNA中的基因拷贝数。
换算公式具体是浓度（单位为ng/ul）×6.02×10^23/（分子量×10^9）。分子量是用DNAMAN计算的，3Kb多长的质粒分子量大约为2×10^6。
另外再请问如果测定基因组中外源基因的绝对拷贝数时（即某条染色体上整合了几个拷贝的外源基因）在测定该基因的同时用什么内参比较好。谢谢了！
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summerxx[使用道具]
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发表于 2016-1-7 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有一个问题你注意到了没有？ 用Genomic DNA和质粒DNA做模板时的PCR效率是不一样的。因此严格地说，检测genomic DNA应该用Genomic DNA做标准品，除非你优化你的RT-PCR反应并证明他们的反应效率是一样的。
有个简单的方法可以检测：
你看看质粒标本中，相差10倍浓度的样品的Ct值应该差3-5左右。看看genomic DNA相差10倍浓度的样品的Ct值相差是多少？应该会比质粒的要大。所以那质粒做标准曲线检测基因组的copy数，应该首先考虑这个问题。许多文献用这样的方法，是否正确，值得斟酌。
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superboy[使用道具]
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 小中大

那我用一个内参的基因作为对照同时来扩增的话是不是就能克服上面所说的质粒与基因组DNA之间PCR效率的差别呢？
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summerxx[使用道具]
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发表于 2016-1-7 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

好像没有用，设内参的目的只是证明参加反应的DNA一样。而并不能影响PCR反应本身。
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发表于 2016-1-7 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我正在做定量PCR,相差10倍浓度(原浓度4.3*10的7次方copies/反应管)的样品的Ct值分别为20.944,25.286,28.208,30.060,33.105,35.608,35.688,6#-7#个稀释度的数据很相近,做了标准曲线R2=0.966,请问是否太低了,有说服力吗?SadSad
另外,我觉得用重组质粒定量是可行的,因为在提取基因组核酸时干扰比较多,可能提取的核酸相对不纯,用于定量不稳定,而细菌质粒提取方便,也较纯吧,我是初学者,不知是否正确.
另外不知DNAMAN网上能否下载?谢谢!!
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taoshengyijiu[使用道具]
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 小中大

做复孔或三孔，取均值会好些。
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