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标题:【转帖】DNA Bisulfite处理以及甲基化特异PCR

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【转帖】DNA Bisulfite处理以及甲基化特异PCR


求助坛内有经验者:
在DNA Bisulfite 处理以及甲基化特异PCR的准备工作时候,遇到了一些困难。
先不提DNA Bisulfite 处理以及甲基化特异PCR的意义了。
1.应该说甲基化特异PCR是1996年开始的,原始论文:Methylation-specific PCR: A novel PCR assay for methylation status of CpG islands (见下贴附件)。
其中关于DNA的Bisulfite处理见本贴附件。
2.而在《Current protocols of Human Genetics》里面也有《Methylation-specific PCR》这一章(见下贴附件)。现在大部分文章还是引用这两个的。
3.我也search了dxy里的帖子,几乎都看了,肿瘤所的战友帖子如下:
肿瘤所DNA处理(亚硫酸氢钠)
第一天
1.  稀释2ugDNA(用双蒸水)至10ul(1.5ml离心管)
2.  加1.1ul 3M的NaOH,混匀
1.5g NaOH+12.5ml H2O----3M NaOH
3.  37度温浴10min(水浴)
4.  6 ul 10Mm的氢鲲(hydroquinone)----色转黄
氢鲲的配置(需现配):
55mg氢鲲+50ml H2O-----10Mm的氢鲲
5 轻轻摇匀
6  加104ul的亚硫酸氢钠(Bisulfite)(3.6M)( Ph5.0 ,用NaOH调Ph)
亚硫酸氢钠(需现配): 可用8份
2.88g亚硫酸氢钠+5mlH2O
0.85ml 3M NaOH稀释上述5ml液体至pH 5.0
7  加200ul 矿物油至管顶端, 50度温浴18小时(过夜)
第二天
8  1%琼脂糖,每管加1ml,样品数*2,放200ulTip头,凝固。
9  把样品吸出,至孔中,1小时后转移至另一孔,再放置1小时。
10  离心,洗脱(最大转速为13000转/分)
11   加11ul 3M NaOH 至洗脱液,37度,15分钟。
1g NaOH+8.3ml H2O----3M NaOH
12   加44ul 8M NH4Oac,1ul的糖原(glycogen)及三倍体积(约300ul)冰冷乙醇(100%),负20度过夜。
0.6166g+1ml H2O----8M NH4Oac
第三天
13  4度离心4min(14500转/min),以70%乙醇洗沉淀物
真空干燥,加30ul H2O,37度促融,-70度冰存


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附件
2016-1-7 17:14
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我的预想实验步骤大致如下:
DNA的bisulfite处理;甲基化PCR; 变性聚丙酰胺凝胶电泳; 377或3100 测序(非310或3700;非毛细管型)
在《Current protocols of Human Genetics》里面也有《Methylation-specific PCR》这一章,列出了需要的材料:
Materials
Sample DNA
Positive control DNA, previously determined to be methylated
Negative control DNA, previously determined to be unmethylated
2 M and 3 M NaOH
10 mM hydroquinone (prepare fresh before use; see recipe)
3 M sodium bisulfite (prepare fresh before use; see recipe)
Mineral oil
DNA Wizard cleanup kit (Promega) or equivalent
80% isopropanol, room temperature
Autoclaved distilled water, 60° to 70°C and room temperature
Electrophoresis buffer (preferably TBE buffer; APPENDIX 2D)
10 mg/ml glycogen
10 M ammonium acetate
100% and 70% ethanol, ice cold
10× PCR amplification buffer (APPENDIX 2D) with 15 mM MgCl2
25 mM 4dNTP mix (APPENDIX 2D)
300 ng/µl sense and antisense primers
Taq DNA polymerase
Vacuum manifold
Dedicated micropipettors for setting up PCR reactions
0.5-µl PCR tubes or strips
Thermal cycler with tube-controlled temperature monitoring
Additional reagents and equipment for nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis and gel staining and photography
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比较了肿瘤所的秘方和这些protocol,大致相同,在部分试剂和DNA的量方面有些区别(这可能是经验吧)。
1.看来《Methylation-specific PCR: A novel PCR assay for methylation status of CpG islands (1996)》这篇文章,有些初级疑问:里面加的1ug samon sperm DNA (SIGMA) 是做载体的吧?
2.在《Methylation-specific PCR》里面,必需的材料也包括Positive control DNA, previously determined to be methylated和Negative control DNA, previously determined to be unmethylated,这如何办?
3.有用过3100或377在这方面的经验吗?两者有何区别?
附件论文:Methylation-specific PCR: A novel PCR assay for methylation status of CpG islands (1996)太大了,1.6M, 如有所需,PM。
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我把肿瘤所的protocol和《Current protocols of Human Genetics》里面翻译了并作一个比较,如下(红色字体为肿瘤所的,蓝色为翻译的protocol):
第一天
1.  稀释2ugDNA(用双蒸水)至10ul(1.5ml离心管)
稀释1ug DNA(用双蒸水)至50ul(1.5ml离心管)
2.  加1.1ul 3M的NaOH,混匀;1.5g NaOH+12.5ml H2O----3M NaOH
加5.5ul 2M的NaOH,混匀;
3.  37度温浴10min(水浴)
37度培养10min
4.  6 ul 10Mm的氢鲲(hydroquinone)----色转黄
氢鲲的配置(需现配):
55mg氢鲲+50ml H2O-----10Mm的氢鲲
加30ul新配置的10mM 氢鲲到每个管
5 轻轻摇匀
6  加104ul的亚硫酸氢钠(Bisulfite)(3.6M)( Ph5.0 ,用NaOH调Ph)
亚硫酸氢钠(需现配): 可用8份
2.88g亚硫酸氢钠+5mlH2O
0.85ml 3M NaOH稀释上述5ml液体至pH 5.0
加520ul新配置的3M 亚硫酸氢钠到每个管,并确认混匀
7  加200ul 矿物油至管顶端, 50度温浴18小时(过夜)
加~50ul矿物油覆盖液面,50度培养16小时
第二天
8 1%琼脂糖,每管加1ml,样品数*2,放200ulTip头,凝固。
9 把样品吸出,至孔中,1小时后转移至另一孔,再放置1小时。
10 离心,洗脱(最大转速为13000转/分)
11 加11ul 3M NaOH 至洗脱液,37度,15分钟。
1g NaOH+8.3ml H2O----3M NaOH
12 加44ul 8M NH4Oac,1ul的糖原(glycogen)及三倍体积(约300ul)冰冷乙醇(100%),负20度过夜。
0.6166g+1ml H2O----8M NH4Oac
加1ml DNA Wizard cleanup reagent到每个管并将混合物加入kit中提供的miniprep column中;
使用真空装置,用80%的isopropanol 洗脱。将column置于干净的,已经做了标记的1.5mlmicrocentrfuge tube中,加50ul60度到70度的热水,1分钟离心。
加5.5ul 3M NaOH 到每个管,室温培养5min;
加1ul 10mg/ml的glycogen做为载体,再加17ul 10M醋酸胺和3倍体积的冰乙醇。-20度沉淀,数小时到过夜。
第三天
13 4度离心4min(14500转/min),以70%乙醇洗沉淀物
真空干燥,加30ul H2O,37度促融,-70度冰存
离心25min,弃上清,70%冰乙醇洗脱,再用20-30ul双蒸水。
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请有经验者多多指教这方面的经验教训以及各种细节。
关于那篇文章,很多战友都可以轻松搞定,1996-Methylation-specific PCR-a novel PCR assay for methylation status of CpG islands.pdf,如果大家需要,上我的邮箱。
cuturl('http://mail.yahoo.com/')
ID:chhualong
PW:12345678
见里面的Draft文件夹。
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准备购买这样的,不知道怎么样?
Wizard® DNA Clean-Up System    Promega  100 preps
Hydroquinone     Sigma 25g; >99.0%
Sodium hydrogensufite     Sigma   500g; >99.0%
Ammonium acetate     Sigma   50g; >99.0%
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[iframe]http://www.protocol-online.org/prot/Detailed/3160.html[/iframe]
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有现成的 CpGenome™ DNA Modification Kit ,chemicon 公司(原intergen 公司),货号 s7820,吉泰公司有售,报价三千九百多,可打8.5折,只需额外准备试剂如下:
Reagents
a. NaOH pellets
b. 70%, 90% and 100% EtOH
c. β-mercaptoethanol
d. TE Buffer (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.5)
它的 protocol我已传至公共邮箱,希望对你有用。另外我把我自己翻译的中文 porotocol 附上,见下。翻译不好请别笑话,另请麻烦也请通知我一下。
2.2 DNA修饰
2.2.1 取旋盖1.5ml离心管,加水100µL,再加1.0µg DNA,最后加7µL 3M NaOH,混匀。
如样品中DNA不足1.0µg时,加 DNA 修饰试剂IV,补水使总体积达到100µL,然后加7µL 3M NaOH,混匀。
(98µL水 + 2µL DNA 修饰试剂 IV + DNA样品 + 7µL 3M NaOH)
2.2.2 50℃ 10min
2.2.3 加550µL新鲜配制的DNA 修饰试剂 I,漩涡混匀。
2.2.4 50℃ 16h。
2.3 完成化学修饰,DNA洗涤
2.3.1 重悬试剂Ⅲ,漩涡混匀,确保混匀。
2.3.2 取重悬好的试剂Ⅲ5µL至上述DNA溶液中,再加入750µL试剂Ⅱ,轻轻混匀。
2.3.3 室温孵育5-10min,5000g 离心10sec,弃上清。
2.3.4 加1ml70%乙醇,漩涡混匀,5000g 离心10sec,重复三次。
2.3.5 第三次去除上清后,再高速离心2min,吸去残存的上清。
2.3.6 加50µL 20mM NaOH/90% 依存与上述样品中,漩涡混匀,重悬沉淀物,室温孵育5min。
2.3.7 5000g 离心10sec,吸取上清至另一Ep管中,加1ml90%乙醇,漩涡混匀,洗涤沉淀,离心弃上清,重复两次。
2.3.8 第二次上清去除后,再高速离心3min, 吸去残存的上清,室温干燥10-20min.
2.3.9 加TE Buffer(10mmTris/0.1mmEDTA,pH7.5)漩涡混匀。Buffer的量取决于开始时DNA的量。(一般25-50µL)
2.3.10 50-60℃ 15min。高速离心2-3min,转移上清至另一Ep管中。
2.3.11 进行MSP或sequenceing,或储存-15℃~-25℃,可保存两个月;-80℃六个月。可分装,避免反复冻融。
2.3.12 当保存的样品融化后作MSP时,避免将析出的试剂Ⅲ加入,可先离心去除沉淀。
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我找了这个公司的产品,因为地域的差异,差价也大。
CHM S7820 DNA Modification Kit, CpGenome (100 reactions) 1kit 约5500元
CHM S7821 Universal Methylated DNA, CpGenome 10μg 4500元
后者是做阳性对照的,见:cuturl('http://www.funakoshi.co.jp/datasheet/CHM/S7821.pdf') 。
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Methylation-specific PCR 引物在线设计的另一个网址(除了dxy里经常提到的那个),需密码( Username,Password : cpgware)
cuturl('http://www.cpgware.com/')
( Username,Password : cpgware)。
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