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标题:【求助】关于Ct值、溶解曲线问题

yes4[使用道具]
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发表于 2016-1-8 10:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于Ct值、溶解曲线问题


我是做荧光定量的新手，今天发现，Ct值都很大，超过30，且溶解曲线的峰值出现在60-70之间，扩增片段不超过200.不知道为什么，跑琼脂糖电泳后发现均有带，如果是表达量少的话，这样的结果可靠吗？
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loli[使用道具]
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发表于 2016-1-8 10:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
扩增片段不超过200bp，那么扩增片段的溶解度曲线的峰值，应该落在80以后。
如果你只是出现在60-70之间，个人感觉应该不是目的片段的峰值。
你的引物做普通PCR跑电泳，引物带是否很明显？
而且你说你的CT值都超过30，如果你的引物带很明显，我觉得60-70之间的峰，应该是引物的峰，可能因为引物峰高，而后面的产物峰反而被盖过看不出来了。
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yes4[使用道具]
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发表于 2016-1-8 10:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我跑琼脂糖胶后，引物带不明显，几乎看不出来，倒是目的片段带明显。我用10μm的引物，加了0.4μl，不知道是怎么回事。
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loli[使用道具]
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 小中大

你的引物浓度用的不高。
你跑琼脂糖胶的PCR循环数用的是多少？
做定量PCR时，用的是哪家公司的mix，定量PCR的仪器是哪个公司的什么型号？
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yes4[使用道具]
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发表于 2016-1-8 10:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

溶解曲线的峰值出现75-80之间，别人一般是出现在80多，Ct值比较靠后，跑琼脂糖胶的PCR就是用的荧光定量的产物检测的，用的是ABI的mix.
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发表于 2016-1-8 10:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

难道你做实时定量的时候不带一个阴性对照孔吗？阴性对照的溶解曲线的那个峰不就是引物的吗？另外，CT值在30之后我的经验就是扩增效果非常不好，建议同时结合溶解曲线和内参一起分析。
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发表于 2016-1-8 10:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
当然也有可能就是你的目的条带的峰。可以自己动手算一下你的目的基因的TM值大概是多少，好有个参考。园子里可以找到相关帖子的。
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idea2011[使用道具]
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发表于 2016-1-8 10:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

溶解曲线的峰值出现75-80之间 对目的片段不到200bp的来说是正确的
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发表于 2016-1-8 10:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也是做荧光定量的新手，Ct值都很大，超过40，机器均显示Undert,溶解曲线的峰值出现在80左右，扩增片段128bp.不知道为什么，跑琼脂糖电泳后发现均有带，如果是表达量少的话，这样的结果可靠吗？由于没有CT值无法分析结果，我下一步该怎么做！谢谢


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qhyu[使用道具]
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发表于 2016-1-8 10:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还是跑个page胶，琼脂糖的分辨率不高，如果不是探针法，只是染料法，特异性很关键
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