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标题:【求助】这是我提取的RNA电泳图，新手请教问题

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发表于 2016-1-8 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】这是我提取的RNA电泳图，新手请教问题


这是我提取的新鲜组织RNA电泳图，请问是否降解的严重？但是我测得紫外分光光度计值分别是1.699、1.79、1.834，能否用来RT？
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北风那个吹[使用道具]
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发表于 2016-1-8 10:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
为什么电泳显示28S与18S差不多，但侧出来的值又可以RT，以哪个为标准决定RNA的质量？
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发表于 2016-1-8 10:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

怎么没有人回答呢，是不是问题太简单了？
又提了一次，觉得RNA跑电泳就是没有漂亮的条带，降解严重，但是紫外分光光度计值又都在1.7-2.0之间，为什么呢？
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发表于 2016-1-8 10:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

本着试试的态度，拿先前的RNA跑了RT-PCR后，发觉内参出来了，目的条带似有似无的样子，不知道是不是，因为第一次做，总觉得自己做的有问题。
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北风那个吹[使用道具]
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发表于 2016-1-8 10:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

又拿第二次提的组织跑了一次RT-PCR，退火温度降了，结果还不如第一次的，条带更弱了些，还出现引物二聚体，问什么？实验的事情好头痛。
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发表于 2016-1-8 10:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。
2．匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
3．分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30-60分钟。
预期产量：1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：
肝和脾6-10μg ,肾3-4μg ,骨骼肌和脑组织1-1.5μg ,胎盘1-4μg ,上皮细胞8-15μg ,成纤维细胞5-7μg 。
常见问题分析：
得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底
B．RNA沉淀未完全溶解
A260/A280<1.65 ：A.检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高
B．样品匀浆时加的试剂量太少
C．匀浆样品时未在室温放置5分钟
D．吸取水相时混入了有机相
E．RNA沉淀未完全溶解。
RNA降解：A.组织取出后没有马上处理或冷冻
B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃
C.细胞在用胰酶处理时过度
D.溶液或离心管未经RNase去除处理
E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5
DNA污染: A. 样品匀浆时加的试剂量太少
B.样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液
蛋白聚糖和多糖污染: 沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中,每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2M NaCl)混合离心,按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。
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发表于 2016-1-8 10:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也是新手，但是我觉得你的RNA降解的挺多，5S明显增多，比28s和18s都亮，如果样品多的话建议舍弃。如果你的目的基因是大片段的话，那么就不能出来了，因为RNA都降解成小片段了，那么RT之后也是小片段，你就不可能P出大片段的目的基因。我个人看法，仅供参考
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北风那个吹[使用道具]
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 小中大
谢谢战友们的帮助，忘记贴我的图了，DNA marker 是1kb ladder的，目的条带是789BP，内参是600多的。
附图左边是第一次pcr，右边是第二次PCR，目的条带较弱，还有一条非特异性的带跟着
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发表于 2016-1-8 10:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我敢着提RNA，怕组织冻存的太久已经降解了，发觉提的越来越差。都找不出原因，分光光度计测值测得都离谱了。
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发表于 2016-1-8 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

OD值是用来检测样品纯度的，而电泳是检测样品的完整性。一个好的样本，这两个指标应都处于最佳状态。但根据实验的要求而异，如果是扩增小片断，完整性的要求不是很高，你的降解程度也可用于后续试验，如果是大片断，那就要重新提取了，看是哪一部分降解了。
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