PCR仪

多谢各位高手赐教！！！本人不胜感激。
昨天我将两个基因片段的量提高到1ng（100ul体系），同时相应提高外侧两条引物的量，电泳结果在2000bp之前的位置得到了目的条带，但是很淡，而且条带拖尾很明显，奇怪的是，在2000bp之后也有一条宽亮度与目的条带很相似的条带，请问各位高手是否遇到过这种情况？条带拖尾严重是不是可以通过提高退火温度来解决？怎样可以使目的条带更清楚些？谢谢！！！

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一年前做过SOE-PCR，效果不错，但是期间也遇到许多挫折，愿与大家分享解决方案：
做SOE遇到的第一个重大问题就是这个拖尾，经过阴性和阳性验证无体系污染和DNA聚合酶问题，后来运用降落PCR得以解决，效果很不错，拖尾明显减弱，条带亮度和特异性明显增强，因此，你可以用高于Tm值5-10度先进行10个循环，然后再用比较低的退火温度如55度或者Tm-10度来进行30-35个循环，可以试试看啊，说不定会有很意想不到的效果！
2.其次就是SOE引物设计的问题，我在设计引物之初不敢下手，可是实在没有人愿意帮忙设计，只好自己整，没想到居然效果都还不错，虽然后面的重叠延伸遇到非特异性拖尾，但是还是能够解决的，所以感觉引物设计基本还是成功的，后来又设计过几次，每次都能做出满意的结果，所以请那些想用SOE但是不敢下手设计引物的兄弟姐妹放手去设计，没有什么高难度的，但是以下几点需要注意：
（1）如果是用的PP5，一定要保证不能有False Priming；
（2）不要怕设计长引物，我设计过的最长引物为～60mer，只要保证足够长的重叠区段和足够效力的引发区段即可（我一般重叠区设计15-25mer，引发区设计13-18mer）；
（3）注意引物Tm值的平衡，一般控制在5度以内；
（4）如果是用于突变，一定要将突变位点设计在引物的中段近5'端，才能保证突变的有效性。
3. 第一步的两个模板需要切胶回收纯化，虽然有损失，但是绝对有利于下一步重叠延伸，如果是突变引物，则需要先进行无引物的PCR反应5-10个循环，以保证突变体的形成，然后加入上下游引物完成整个PCR反应。
以上是我做了快一年，大约5次SOE-PCR实验的经验，与大家分享，希望批评指正！