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标题:[求助]请问有谁用过生工自产的trizol?好用吗?

嘉年华[使用道具]
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DNA酶处理完了用酚抽氯仿抽不久可以了
当然如果用trizol可以用它抽
我用生工的感觉很差,总是降解,但是有人用的没事情,正反面的信息我都听说过,所以如果手头宽裕建议不要用  
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头发很短[使用道具]
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关于沉淀,你看一下其他方法(比如一步法试剂盒)对比一下就可知道,异丙醇是沉淀RNA,乙醇沉淀DNA,如果你用TRIZOL,乙醇沉淀时见有白色沉淀,那是DNA,我们用此沉淀跑过电泳,是一条很亮的DNA带。

===============================================================================================================

错误的说法,希望大家不要轻信,自己查一下分子克隆上的异丙醇和乙醇的区别。我凭记忆:两者都可以沉淀核酸(DNA和RNA),只不过所用体积不一样,异丙醇所用体积小,是和上清等体积,乙醇要2或2.5倍,而且分之克隆上我似乎记得还说异丙醇容易沉淀盐,在没有体积限制时,一般不用,而用乙醇,TRIZOL提取过程中似乎没多少盐离子在里面。也许你跑的电泳有问题,我们跑RNA有时变性不好而且有杂质时,电泳图上就会显示孔里很亮,变性好了,同样的RNA样品就出现了明显的28S、18S带。另外,你提的RNA一直有DNA污染,可能TRIZOL的pH值有问题,DNA在酸性条件下易溶于有机相,这是TRIZOL提取过程中加氯仿离心后DNA在中间相和下层有机相中,但是理论上和实际上上层水相都是有DNA的,只不过很少(pH对的情况下)。要真正去DNA污染,就要加RNase free 的DNase,这是很多论文里写的。
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我也用了生工的Trizol提过肾脏的RNA,每次都能提出来,但是每次都有降解,一开始以为是自己陪液体的错,后来重新配了液体又重新消毒了玻璃器皿,虽然跑电泳都能有三条带,但是每次降解都挺多的。
另外,小妹也有几个问题想请教:
1、在跑电泳的时候怎样才可以知道有没有DNA污染?
2、是不是一定要测OD值
3、同意个标本可以分别提取好多次,每次提取后的RNA经过跑电泳后发现均没有降解时能不能混在一起;前面有个高手说要测定质量后才混,这个质量时什么,是没有降解还是要OD值相同才能相混。
4、如果需要作realtime RT-PCR,反转录前要不要测定什么,譬如OD值怎么的来保证可比性。
谢谢  
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两者都可以沉淀核酸(DNA和RNA),只不过所用体积不一样,异丙醇所用体积小,是和上清等体积,乙醇要2或2.5倍,而且分之克隆上我似乎记得还说异丙醇容易沉淀盐,在没有体积限制时,一般不用,而用乙醇,TRIZOL提取过程中似乎没多少盐离子在里面。
提的RNA一直有DNA污染,可能TRIZOL的pH值有问题,DNA在酸性条件下易溶于有机相,这是TRIZOL提取过程中加氯仿离心后DNA在中间相和下层有机相中,但是理论上和实际上上层水相都是有DNA的,只不过很少(pH对的情况下)。要真正去DNA污染,就要加RNase free 的DNase

写的比较明白了,我们实验室里就有人从来不用异丙醇,也提得很好,但问他原理到底和乙醇在用法上有何区别,他说不太懂。这回偶懂了,再次感谢!
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向大家汇报一下我用生工自产的trizol提的RNA做RT-PCR的情况,(RNA的电泳图我贴在上面8楼了)测A260/280为2.21

我用这样的RNA往下做(用takara的ver3.0RT-PCR试剂盒,内含AMV反转录酶、EX Taq热启动版本)

开始的5对引物跑的很顺,都出来了跟目的片断大小一致的单一条带..........实验如此顺,我就有点担心会不是假阳性?(我认为RNA内若有DNA污染肯定会导致假阳性的结果,也就是说某段基因组序列可能根本就不会转录、翻译,但是却被我扩出来了,这样岂不失去了我想了解某段基因表达情况的意义了?)

近来又用另外的3对引物跑,结果跑出的单一条带远比我预计的大得多,由此我更加怀疑我以前做的可能都是假阳性了。(我觉得条带比计划的大得多,大概是引物跨了内含子导致的,我正在查找求证)

以上新问题还望各位帮忙解答,在此先谢 了!我自己也在找问题出在哪里
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小葵[使用道具]
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我提取RNA主要用来做RT-PCR,完全没有问题。从一般的琼脂糖电泳来看,是有降解,做甲醛变性琼脂糖电泳估计会好的多。我正打算做体外转录,要做甲醛变性琼脂糖电泳,到时看效果如何。一步法提取的RNA中混有少量的基因组DNA可能性非常大,有时RT-PCR时出现非特异性条带就是因为基因组DNA的存在,用DNase消化就是,若仅仅为了消除由此引起的非特异性条带,也可尝试改变引物。
Good luck!
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qiangren789[使用道具]
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建议大家不要用生工的trizol了。后来我总出问题,到处找原因,也没用;后改用invitrogen的就完全好了!我的真实经验。  
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qiangren789[使用道具]
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建议大家不要用生工的trizol了。后来我总出问题,到处找原因,也没用;后改用invitrogen的就完全好了!我的真实经验。  
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