PCR仪

我觉得提RNA的关键是Trizol的量要足，一般是10*6~10*7细胞加1ml Trizol，细胞数太多，Trizol的量相对就不足，裂解不完全，影响RNA的质量。一定要充分吹打混匀直至溶液澄清！！这时可以加氯仿往下做，也可以放在－20℃下冻存起来，到需要时再往下做，我放过一个多月再提RNA还是好的。另外加氯仿后要充分振荡混匀呈乳状，然后在室温下静置3~5分钟再去低温离心，分层都很明显，一般都有500~600μl的水相。后面的步骤就是沉淀、洗涤的过程了，最后用DEPC水溶解，按照程序来就ok了！加入异丙醇后也要在室温下静置10分钟再去离心比较好，也有的说在－20℃下静置，我试过，差不多，我感觉在室温下效果还要好一些！

我的经验是，从组织中用TRIZOL提RNA时组织的量并不是越多越好，在一定范围内是正好相反。我曾经做过对比，同一块组织经匀浆后做一定稀释，分别取50、100、150、200ul匀浆液提RNA做反转录PCR，除了组织的量不同外其它条件都一致，结果只有50ul的样品扩出了所需要的目的片段，经克隆测序验证正确。

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您指的“匀浆后做一定稀释”，是从匀浆后的裂解液中取50、100、150、或200ul出来吗，那么用什么稀释它呢？稀释到多大体积，加多少体积的氯仿呢？

另外1ml的裂解液取多大的组织块最好？说明书是50-100mg，我觉得这个范围还是大些？如果大家有这方面的经验，恳请指教！！！

我现在试着从骨骼肌组织提RNA，跑电泳点样孔附近无明显亮带可见，但OD值始终在1.3-1.5,说明还是有蛋白或酚等污染对吗？
虽然琼脂糖电泳可见清晰三条带，无smear降解片状影出现，但5s最亮，28s最暗，逆转录后PCR也没有产物。我想可能就是RNA中混有了蛋白或酚，影响了逆转录过程，对吗？
最后用乙醇洗涤的步骤，是不是和OD值偏低也有影响？因为用异丙醇沉淀后，rna已成胶状沉淀，加乙醇后用不用轻弹管壁至RNA完全溶解后再去离心？
请多指教，谢谢！

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一般来说,提取的RNA OD值偏低可能混有蛋白污染,RAN实际上在酒精洗涤时是不溶解的,应该看到的是白色沉淀,洗时我觉得应该把轻弹管壁弹能够充分洗涤.
逆转录后PCR没有产物的原因很多,不知道你有没有同时跑内参,如果能跑出内参说明你的反应体系是好的;有的RNA有轻度降解时照样能跑出内参， 但对于目的基因特别是长片段及表达不高的就困难了,能否跑出目的基因还要看退火温度,退火温度不合适,也跑不出,当然引物也有关系.