提RNA过程影响纯度和质量的关键是否在TRIZOL和氯仿这两步? - 经验共享

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标题:提RNA过程影响纯度和质量的关键是否在TRIZOL和氯仿这两步?

BUK[使用道具]
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发表于 2011-10-12 12:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

提RNA确实是有很大的操作差别的，不同人做的结果就算是同一试剂，同一材料，同时做都有可能结果差别很大。对于影响结果的原因有：
1.Trizol试剂的问题，因为Trizol里面有酚，而酚是会挥发的，所以试剂保存时间不能太长，尽量避免在较高温度条件下敞口放置。（我实验室一哥们把新订的Trizol室温放置了一个晚上，后来用就不太好了）
2.操作上的问题：1）裂解细胞时一定要把细胞轻轻吹打分散开，不要有成团的，但也不可使劲吹打；2）加入氯仿后的振荡很关键，要是votex的话就过于剧烈了，应该用手使劲的上下左右振荡，这样既能尽可能的把RNA萃取出来，又最大限度的避免了基因组DNA的污染。
基本上主要的影响就是这些了，一般注意了这些就可以得到较好的重现性了。

少林弟子[使用道具]
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发表于 2011-10-12 12:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

那如果组织用超声细胞仪粉碎和用匀浆有区别吗，超声粉碎会切断RNA吗

PCR[使用道具]
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发表于 2011-10-12 12:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我觉得提RNA的关键是Trizol的量要足，一般是10*6~10*7细胞加1ml Trizol，细胞数太多，Trizol的量相对就不足，裂解不完全，影响RNA的质量。一定要充分吹打混匀直至溶液澄清！！这时可以加氯仿往下做，也可以放在－20℃下冻存起来，到需要时再往下做，我放过一个多月再提RNA还是好的。另外加氯仿后要充分振荡混匀呈乳状，然后在室温下静置3~5分钟再去低温离心，分层都很明显，一般都有500~600μl的水相。后面的步骤就是沉淀、洗涤的过程了，最后用DEPC水溶解，按照程序来就ok了！加入异丙醇后也要在室温下静置10分钟再去离心比较好，也有的说在－20℃下静置，我试过，差不多，我感觉在室温下效果还要好一些！

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完全赞同。组织量令少勿多

RNA提取少不怕，就怕DNA污染

@STAR@[使用道具]
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发表于 2011-10-12 13:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问加异丙醇后,需要混匀吗?

@木木@[使用道具]
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发表于 2011-10-12 13:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问：你们题mRNA时用的时那的EP管，在12000转时，出现破裂现象没？请问在那能买到好质量的EP管或者离心管？

flower@@[使用道具]
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