【求助】哪位好心人把荧光定量PCR的具体步骤告诉我啊?

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标题:【求助】哪位好心人把荧光定量PCR的具体步骤告诉我啊?

8s5g[使用道具]
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发表于 2016-2-5 17:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

本来是做普通RT-PCR的,但是老板突然改变注意想做荧光定量RT-PCR,举手无错啊,请大家帮忙,把具体步骤告诉我.我已经读了一些此类文章,但是就是没有一个完整认识....谢谢各位大侠...
另:real-time PCR是否就是荧光定量PCR,还是其中一种?
很菜的问题,汗颜...

nn255[使用道具]
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发表于 2016-2-5 17:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

除常规RT－PCR外需解决下面问题：
1、标准品：做标准曲线用，一般难以购买现成的，可自己克隆，分数量级稀释后做相对定量，从曲线上得到Ct值比较，或换算成copy数比较
2、设计荧光探针：一般用TaqMan水解探针即可，ABI公司的PrimerExpress软件很好用
real-time PCR多通过荧光信号的实时变化判断产物量，实现real-time目的，real-time PCR不一定就是做定量的，

hyuu[使用道具]
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发表于 2016-2-5 17:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我有个ppt，可以给你，但是太大了，传不上，怎么办？？

seagate[使用道具]
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发表于 2016-2-5 17:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

上海轩昊公司网站上有比较详细的荧光PCR的实验方案，链接是：cuturl('http://www.transhold.net/pcrmm001.htm')

49888[使用道具]
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发表于 2016-2-5 17:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

在使用荧光进行PCR定量时，荧光信号与产物模板数成一一对应的关系，检测荧光的信号就可以对PCR产物定量。但是，在使用终点法测定的重复性并不好。由此PE公司于1996年发明了实时荧光定量PCR，临测每个循环的荧光强度，并使用Ct值进行分析，很快得到大家的接受，广为应用。
下图是PE公司在同一台PCR仪上对相同模板进行96次扩增的扩增曲线图。
由图可以看到当扩增越靠后定量的重复性就越差。我个人认为主要是因为①荧光定量技术要求在低浓度坏境。因为荧光检测定量原理是在忽略分子间相互作用的情况下建立的。如果分子浓度高了，影响作用很复杂，而PCR扩增产物是高浓度的，因此重复性变差也很容易理解。②由于扩增末期，扩增效率可能因为大量的靶序列而产生不可控的影响。
　　同时，由上图我们也可以看出，在Ct值所在处重复性却惊人的好。Ct值，C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。而所设阈值都很低。还而言之，Ct值分析实际上就是低浓度的荧光值分析。由于是低浓度，影响因素小，误差没被放大，所以具有良好的重现性。
　　固定循环数后，荧光信号与模板数成正比，但当固定荧光信号值后，模板数就与循环数成反比。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（如图2所示）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。