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标题:【求助】RNA提取后有必要用DNA酶处理吗?

applebook=213[使用道具]
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【求助】RNA提取后有必要用DNA酶处理吗?

我在RT-PCR实验中提取RNA后,发现一些不该出现强表达的基因,最后PCR产物也有很多。我有些怀疑是否是RNA提取过程中混有DNA。请问RNA混有DNA会出现靶基因PCR产物增多的现象吗?您平时实验中RNA提取后是否常规用DNA酶处理呢?
此外RNA产物用DNA酶处理有没有什么好的方案?按照Promega的方案加DNA酶工作液后会造成离子浓度的变化,RNA须重新抽提。即麻烦,又可能损失RNA。不加工作液,DNA酶效率又不高。我看见有的文章就单加高浓度的DNA酶。
还有一个问题:我提取的胰腺组织RNA降解得非常厉害,RNA电泳一片模糊。别的组织则无问题。我都是按照TRIZOL说明书操作的,请问您有什么好建议吗?
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ns5fan[使用道具]
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RNA提取后有没有必要用DNA酶处理主要和你的用途有关。如果仅仅是扩某个基因,那就无所谓。如果是定量RT-PCR,则最好DNA酶处理一下,或者引物需跨exon. 我们这是用QIAGEN的RNase-free的DNase处理的,不是加了DNase就结束了,为了去除DNase(蛋白)和buffer等可能影响到后期操作的因素,所以酶解了DNA后必须纯化RNA(QIAGEN的纯化柱),这样得到的RNA我们才用于定量实验。即使这样,我们在做real-time PCR时都要加一管仅加RNA的作为阴性对照(排除DNA的污染)。
btw: OD260/280<1.6 不能作为是否弃用RNA的指标。由于各地水质的不同在这方面会有差别。我们这以前用millipore纯化系统的得到的水(应该说是很好的)来溶解RNA,但有时OD也会到1.5-1.6之间,现在都是用sigma的水来溶解RNA,在 OD260/280上没出过问题。
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eor[使用道具]
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我不懂楼上所提出的问题,但是我想向你请教一个问题:你从组织中提RNA是怎样做的?能详细一点告诉我吗?我已做了近两个月的RT-PCR了,材料如果是细胞就能保持每项次成功,可是从组织块中提时,每次都在加入异丙醇后离心就看到白色沉淀,RT-PCR从来没有成功过,真是烦!
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yhn[使用道具]
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引物跨内含子的说。
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applebook=213[使用道具]
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我没有什么特殊的方法,就是按照说明书做的。你既然提细胞能成功,提组织应该问题不大。加入异丙醇离心后我也能看见白色沉淀,好象没什么问题呀。RNA应该也能看见的。如果还没离心就看见沉淀就有问题了。不知你用的TRIZOL是那个公司的,会不会有问题。附上我的操作程序,不知对你有没有用。
大鼠放血处死后立即取胰腺和肺组织约50mg,迅速浸入液氮速冻,-70oC保存。
总RNA提取按照说明书所述方法并略做改动如下:取出冻存样本50mg,迅速转入预冷的研钵中,加入液氮,于研钵中研细。加入0.5mL Trizol继续研磨并与组织充分混合。将匀浆液转入1.5mL离心管中,-70oC保存待处理。
1)  将Trizol匀浆液解冻,4oC,12000g离心10分钟
2)  吸取上清液至另一离心管,15-30oC,放置5分钟
3)  加入氯仿0.1mL(1/5Trizol量),震荡15秒,15-30oC,放置10分钟。4oC,12000g离心15分钟
4)  吸取2/3上清,转至另一离心管
5)  加异丙醇0.25mL(1/3-1/2 Trizol量)沉淀RNA,轻轻颠倒混匀,15-30oC,放置10分钟。4oC,12000g离心10分钟
6)  弃上清,缓慢沿壁加75%乙醇700ul,轻轻颠倒洗管壁,小心弃乙醇
7)  重复清洗一次
8)  移液枪吸去所有上清,干燥沉淀5分钟
9)  加入20-50ul Rnase-free的蒸馏水完全溶解RNA沉淀,-70oC保存。
取2ul RNA溶液经2%琼脂糖凝胶电泳,鉴定RNA质量。取1ul RNA溶液100倍稀释,用核酸蛋白检测仪进行分析、定量。OD260/280<1.6者弃用,计算标本RNA浓度。
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xiaoxiaoniao[使用道具]
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楼主所做的是动物方面的,我们实验室都是做植物的。现在也出现与你相似的问题。我们用不同的植物材料提取总RNA,电泳后都没有明显的DNA污染,之后反转录,用简并引物扩增同一基因片段。有两种植物扩出该基因,同源性很高,但另一植物中扩出的片段较大,测序之后找到了引物序列,但BLAST之后发现与要扩的基因没有任何相关,而且多与基因组序列同源!
现在我们怀疑PCR扩增时是以RNA中的DNA为模板的,而不是以反转录得到的cDNA为模板的。
以前连续提过数次该植物的RNA,但是每次都会有部分DNA,这次的DNA是最少的。所以重提似乎并不是最好的办法,但用DNAase消化又存在问题。再往下做有点困难了。
另外,如piscean所说,若引物跨内含子的话,以cDNA为模板的扩增效率应该比较低吧?可是连续几次都扩出来了,而且测序结果似乎含有内含子。这种情况怎么解释呢?
希望诸位多多赐教,好指导我们实验的顺利进行,谢谢!
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ns5fan[使用道具]
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RNA提取后有没有必要用DNA酶处理主要和你的用途有关。如果仅仅是扩某个基因,那就无所谓。如果是定量RT-PCR,则最好DNA酶处理一下,或者引物需跨exon. 我们这是用QIAGEN的RNase-free的DNase处理的,不是加了DNase就结束了,为了去除DNase(蛋白)和buffer等可能影响到后期操作的因素,所以酶解了DNA后必须纯化RNA(QIAGEN的纯化柱),这样得到的RNA我们才用于定量实验。即使这样,我们在做real-time PCR时都要加一管仅加RNA的作为阴性对照(排除DNA的污染)。
btw: OD260/280<1.6 不能作为是否弃用RNA的指标。由于各地水质的不同在这方面会有差别。我们这以前用millipore纯化系统的得到的水(应该说是很好的)来溶解RNA,但有时OD也会到1.5-1.6之间,现在都是用sigma的水来溶解RNA,在 OD260/280上没出过问题。
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ero11[使用道具]
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8
 
8楼
好象我们实验室以前有个师兄做的RT-PCR产物中就含有内含子,就是说他刚好把那个还没剪切好的mRNA给反转录过来了,所以含有内含子,不过这样的几率应该比较小的。我总觉得我以前的那个师兄特别倒霉。
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duchy[使用道具]
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请问在您的操作过程中,假如氯仿离心后只吸取2/3的上清,这样操作虽然可有效避免DNA污染,但会损失RNA吗?我做的是cDNA文库构建,所以对RNA要求很高,但提取出的总RNA经电泳后显示有DNA污染,现在不知问题出在跑电泳的过程中,还是提RNA的过程中?如何避免?
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duchy[使用道具]
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10
 
10楼
补充一下:我的总RNAOD260/280为1.7,希望大家多多指教!
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