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标题:【求助】荧光定量PCR标准曲线

蒲公英[使用道具]
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发表于 2016-2-6 10:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】荧光定量PCR标准曲线

我想构建质粒标准品建立标准曲线，起始浓度为41ng/ul，拷贝数为10的19次方，倍比稀释后用10的11、9、7、5次方拷贝数的质粒进行荧光定量PCR，可是每次CT值都分不开，已经做了好几回了，是条件没优化好吗，要怎么优化呀，急求解决方案呀？而且溶解曲线峰在79度左右。


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lorri[使用道具]
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发表于 2016-2-6 10:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看第一个图，阈值对应在25、26个Ct值左右，这个时候才开始指数扩增，曲线分的不够开，说明浓度梯度不够大，起始浓度41ng/ul也比较低。可以考虑增加起始浓度（对应Ct值在15~18个最佳），浓度梯度跨大点。
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发表于 2016-2-6 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

做负对照了吗？
如果负对照正常，一种可能是起始模板的浓度比较低造成的，也有可能是标准品稀释造成的；
如果负对照也出现了扩增，就麻烦了，从长计议吧。
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发表于 2016-2-6 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

阴性对照怎么做都是阳性呢
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发表于 2016-2-6 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 33号 于 2016-2-6 10:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

阴性对照怎么做都是阳性呢

阴性对照可以使用超纯水吧
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发表于 2016-2-6 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 bling 于 2016-2-6 10:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

阴性对照可以使用超纯水吧

恭喜你！（开玩笑了）我觉得你的实验环境等污染了，配好试剂不加模板都能做出来，不信你试试。
还有你说的稀释，其实根本就没有稀释，你的数据我觉得不可信，应该都是污染的结果。阴性对照的溶解曲线也表明能扩增出你的目标产物，不是非特异荧光信号。
我从来没见过10的19次方浓度的DNA，你算一算这是什么浓度啊，能溶解么？PCR终产物的DNA浓度一般才在10的12-14次方...
较好的解决方法：换引物了。
另外请注意：应该在不同建筑的实验室中构建标准品。在同一个实验室既做质粒标准品又做荧光PCR，就会使PCR空白反应液都能扩增，不信你可再试。
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发表于 2016-2-6 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

明显污染。
再有就是拷贝数为10的19次方的模板Ct值25，有点不可能。
另外，目的片段应该是没扩增出来。
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发表于 2016-2-6 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
荧光定量PCR是在单独的一个屋子里做的，上面的图是10的11、9、7、5次方拷贝数的质粒进行的荧光定量PCR结果，后来又用10的19、18、17、16、15次方拷贝数的质粒进行的荧光定量PCR结果，图片如下。但是水里还有扩增，最后一条紫色的，不知道是为什么，是引物设计的不好吗？


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蒲公英[使用道具]
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发表于 2016-2-6 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
荧光定量PCR是在单独的一个屋子里做的，上面的图是10的11、9、7、5次方拷贝数的质粒进行的荧光定量PCR结果，后来又用10的19、18、17、16、15次方拷贝数的质粒进行的荧光定量PCR结果，扩增曲线有梯度趋势，图片如下。但是水里还有扩增，最后一条紫色的，不知道是为什么，是引物设计的不好吗？
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发表于 2016-2-6 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.严谨的定量实验必须每次都要要NTC的，即不加模板的负对照；
2.如果NTC也出现了扩增的确是很麻烦，最大的可能性是模板的污染。不知道你的定量使用的染料的方法还是探针的方法，如果是染料法可以分析溶解曲线，不管是哪一种方法，最好再电泳检测一下产物的大小，来判断是否是模板的污染还是引物二聚体。
3.另外，想提醒你，最好做个复孔检测，来确定实验的准确性。
4.标准曲线不是拿个浓度稀释就可以做的，模板的浓度有个准确的范围。通俗一些，最好的起始浓度为10^8～10^0之间为好，10^19就不可以了，有可能10^9～10^10之间时，不管你怎么做，可能扩增曲线都会重合在一起。
5.标准品的稀释也是很重要的，从高～低稀释时，切记换枪头，稀释手法一致。
6.分区操作，切记！
7.标准曲线制作时，模板填加从低～高。
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