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标题:【求助】奇怪的PCR结果

superboy[使用道具]
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发表于 2016-2-8 22:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】奇怪的PCR结果


今天，用一条引物对六种模板做了下PCR，结果如下：
如图，最左是marker，接下来6条是不同的模板（2-7道），8-11道分别是前面2.4.5.6道PCR的模板DNA，最右边也是marker。
使我疑惑的是：左边有三道点样孔很亮（3-5道），不知是什么原因造成的，好像是PCR结果没有跑下来。是DNA提的不纯，有残余吗？但是右边四道的模板DNA电泳结果却显示质量不错啊。我想既然模板DNA都可以跑下来，为什么PCR结果却滞留点样孔呢？
十分奇怪，在线等！


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2016-2-8 22:18
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newway[使用道具]
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发表于 2016-2-8 22:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的模板是基因组DNA吧？加样空里应该是基因组DNA。你的PCR有问题，几乎就没有扩增！
你的模板要比PCR产物大的多，所以没跑出来很正常！
你就重新做PCR吧！没什么奇怪的！
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yapuyapu[使用道具]
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发表于 2016-2-8 22:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感觉是基因组DNA
1，3-5道，点样空有条带，模版量明显很大，抑制pcr扩增，建议稀释后再作
2，8-11道，感觉你的dna质量也不是很好，不过应该稀释后可以扩得出来
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发表于 2016-2-8 22:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问从图上怎么具体判断DNA的质量？我今天做了下OD检测，确实不太好，有蛋白残留。
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bring[使用道具]
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发表于 2016-2-8 22:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一般来说，基因组DNA较大，所以如果用基因组DNA跑电泳的时候，只跑出一点点距离或聚集在加样孔，所以8-11有这样的现象，顾判断是基因组DNA，同时要注意3-5，8-11，在点样孔有条带，应该是蛋白整合模版DNA之后的现象
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superboy[使用道具]
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发表于 2016-2-8 22:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我今天分别稀释了4倍和8倍，正在等待PCR结果。
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yapuyapu[使用道具]
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发表于 2016-2-8 22:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
又学到了点东西。
我上次作pcr的时候
跑有个目的基因的时候就出现亮带只存在加样孔，好像没跑出来一样，但同一cDNA的另外一目的基因和内参都跑的很好，因我是分别单独加样的，所以根据上面的分析是否考虑是该管模版量加多了。
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superboy[使用道具]
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发表于 2016-2-8 22:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

今天分别稀释了4和8倍，还是没能出来。我在想是不是体系有问题还是稀释倍数不够，真的搞不懂了。
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yapuyapu[使用道具]
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发表于 2016-2-8 22:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还跑不出来，就去吧模版纯化一下，还有给个建议
以后模版不要4倍，8倍稀释
偶以前做的时候，稀释都是10倍，40倍，100倍稀释
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october7[使用道具]
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发表于 2016-2-8 22:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有蛋白残留一般并不影响PCR扩增，对酶切等纯度要求高的实验影响大。
第8道DNA有降解，相应的第2道扩增正常；第11道DNA量很少，相应的第6道扩增正常；其它的DNA浓度太高，完整性太好，这样会影响变性的。
建议：
把其它DNA震荡5min，机械断裂DNA；
稀释很多倍，1000倍以上，PCR灵敏度足够的；
延长预变性时间到10~15min。
结果好了分享一下。
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