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标题:[精华]】RealTimePCR问题专贴--请先看P1的问题汇总

jude[使用道具]
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但是看了您的回复后我还是有几点不明确:

“如此看来即便是不同的目的基因定出来的拷贝数也都是相同的。”
不知这句话如何理解?在一个特定的细菌的基因组中,不同的目的基因定出来的拷贝数为什么是一样的呢?

“但有一点,细菌是分很多种属的,某种基因并不是所有的细菌都有。”
是这样的。但是我需要做的绝对定量只是对某一种特定的细菌的定量,对于特定的细菌来说,总是有特定的保守基因的,这些保守基因在这种细菌的基因组中的拷贝数应该是不会变的。

“大肠杆菌中可能只有O-157的某几个基因才具有致病性,此时定量,就不能简单的以管家基因代替致病基因。”
绝对定量是否需要管家基因我一直没有想清楚,因为只要确定了目的基因(比如您说的致病基因)就可以对细菌定量了。此时又回到了我最初的那个问题:如何通过对基因的定量达到最后对细菌定量的目的?

“这点参考以上吧。”
不好意思,您能否大致说说思路?
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cute[使用道具]
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谢谢楼主,但是我的totalRNA都放在-20度好几个月了,降解的也差不多了,而且现在觉得很郁闷的是,我做阴性对照,就是不加CDNA的,周末做了一次,没有条带,今天做了一次,又有结果,同时另外有两个管是分别不加酶和引物的,两个孔都没有条带出来,现在也觉得很郁闷哪,为什么有时候能跑出来有时侯就跑不出来。
我做PCR只是验证一下有没有表达,并没有测序。
另外一个问题是公司用探针法做得,阴性对照都是加的他们的东西,引物也是,也能跑出条带来,这能说明什么问题?

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不建议您继续做下去了,降解光了的RNA即便出了实验结果也没什么说服力了。现在再讨论实验到底怎么回事,也没什么意义了。
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panda王[使用道具]
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探针与上游引物重合一部分可以么?  
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qiangren789[使用道具]
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我现在用SYBR Green做RT-PCR试验,前两天做了一次,结果阴性批出来了,我当时怀疑是水、引物、MIX(天根的SYBR Green和real mastermix混合而成)被污染了,我今天就把上面的东西全换新的,但是还是批出阴性对照了,做RT-PCR时还应该注意哪些问题?

我还有一个问题就是我在这两次试验的时候,同时都做了标准品的标准曲线,但是一点规律也没有,我重新稀释了两遍还是不行,标准品稀释后的样品得到的Ct值均和阴性Ct值差不多,数值都在17附近,请帮忙分析一下?
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qiangren789[使用道具]
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我现在用SYBR Green做RT-PCR试验,前两天做了一次,结果阴性批出来了,我当时怀疑是水、引物、MIX(天根的SYBR Green和real mastermix混合而成)被污染了,我今天就把上面的东西全换新的,但是还是批出阴性对照了,做RT-PCR时还应该注意哪些问题?

我还有一个问题就是我在这两次试验的时候,同时都做了标准品的标准曲线,但是一点规律也没有,我重新稀释了两遍还是不行,标准品稀释后的样品得到的Ct值均和阴性Ct值差不多,数值都在17附近,请帮忙分析一下?
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阿福[使用道具]
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请教:标准曲线法进行多个基因表达的相对定量时是否每做一个基因的同时都要同时做内参

针对同样的标本我有5个目的基因要做相对定量,由于五个基因的扩增条件不同,所以不能同时上机,每次做一个基因。这种情况下,是不是每做一个基因就得同时做内参。

今天某公司的技术支持说每次都得同时带着内参做,如果真是这样的话,那么当内参的扩增条件和目的基因的条件不同而不能同时上机的话该怎么办?

请指教!!
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=菓子=[使用道具]
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谢谢你上次给我解答的问题,一直还没感谢您呢!呵呵 ,不过又有新的问题要请教您了!具体如下:
1)麻烦您帮我具体说一下稀释质粒模板时的注意事项和一些细节问题,我现在就是无法避免高拷贝对低拷贝的污染问题;加样顺序如何;稀释模板的时候用不用反复吹打,混匀,瞬离;我的标准曲线就是直线性不好,而且现在还是斜率太大了,扩增效率很高,不知道什么原因。
2)我把定量PCR产物拉PCR,发现标准品居然都没有条带,反而样品有隐约的条带。我用普通PCR拉标准品条带很亮,说明引物没有问题呀,唉 ,奇怪了3)我把我的体系给您说一下啊,您看看是不是体系也有问题,我是用试剂法做绝对定量的:20ul体系---SW 8.2ul ; SYBR 10 ul ; ROX 0.4 ul ; P1 (5umol/l) 0.2 ul; p2(5umol/l) 0.2 ul ; 质粒模板 1 ul
一下写这么多,麻烦您了!
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潇湘子[使用道具]
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重合2-3个碱基的话,问题不太大。前提是其他各方面的分析都很好。
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潇湘子[使用道具]
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防污染,主要是将新购买的试剂分成小包装;反应混合液配制的地方和加模板的地方严格的区分;枪、枪头什么的也要严格区分。
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潇湘子[使用道具]
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关于标准品的稀释(以10倍稀释举例)
首先注意不要污染试剂和环境。稀释时,先把各个梯度都加上稀释液,一般都是(3ul原液+27稀释液)用手轻轻弹几下离心管,再离心,此过程反复三次。注意稀释模板时每次原液取出量最少3ul,即每个梯度都是(3+27)并且每次都要更换枪头,千万不能为了节省枪头而试验失败,浪费更多试剂和时间,得不偿失。

一般来说,标准品应该现用现稀释。

做PCR时,在混合液配制区直接把阴性的管子盖给盖上,然后将分装好的各个管子拿到模板添加区,按照低浓度到高浓度的顺序添加。加模板时,每次都要换枪头。

我现在做定量都是买的mix预混液,其中各组分的量是多少我不清楚,但这个应该是对每个反应都有影响的,您标准品不出梯度,应该不是反应体系的影响。

扩增效率高,主要原因:模板稀释不好;模板中有阻害物。这个问题前面的帖子说过,你实验中注意一下。
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