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标题:[精华]】RealTimePCR问题专贴--请先看P1的问题汇总

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发表于 2011-10-13 12:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
关于是不是需要普通PCR来先摸定量PCR的条件
可能还和定量PCR的方法有关

如果是探针法，探针是最主要因素，摸条件时不加探针没有意义，加探针那就不必要上普通PCR仪了，如果做的话的确也会出现yaoshan战友说的情况；

如果是染料法，因为PCR引物二聚体、非特异扩增对结果影响较大，而且染料往往比其他试剂贵，个人觉得摸一下也无妨
个人意见，大家继续讨论～  
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发表于 2011-10-13 12:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想请问一下，做目的基因的标准曲线，也是用和做持家基因扩增曲线同种浓度的cDNA么？ 我用做持家基因的CDNA 分别是1倍 0.2倍 0.04倍 0.008倍 0.00016 倍，做目的基因的标准曲线，扩增效率为什么会很大呢 400%多


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发表于 2011-10-13 12:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的是SYBER Green 染料做的，能否教我一下怎样设计SNP的引物，谢谢，非常感谢！

===========================================================================

SYBR的方法是不可能检出SNP的,目前SNP的检测大多用Taqman-MGB探针,或者Cycling探针来检测.
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潇湘子[使用道具]
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发表于 2011-10-13 12:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想请问一下，做目的基因的标准曲线，也是用和做持家基因扩增曲线同种浓度的cDNA么？ 我用做持家基因的CDNA 分别是1倍 0.2倍 0.04倍 0.008倍 0.00016 倍，做目的基因的标准曲线，扩增效率为什么会很大呢 400%多

================================================================================================

不考虑引物扩增表现好坏和你的模板中是否有阻害物,单纯看模板稀释,梯度就特别不好,相信你把模板稀释好,扩增效率不会这么差.
现在你可以先在仪器上把第一个点和最后一个点去掉,看看扩增效率怎样.

还有一点补充一下,5倍的梯度不是太好稀释,如果你基因表达量比较高的话,选10倍梯度吧.
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猫屎一号[使用道具]
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发表于 2011-10-13 12:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做过10倍10倍的稀释，可是到达10000倍就没有CT值了，所以才改用的5倍5倍的稀释，我把做定量的PCR拿去跑了个琼脂糖电泳，发现条带都弥散了，现在正在提高退火温度试试效果如何。不知道你们有什么好的建议，分享一下，洗耳恭听。  
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发表于 2011-10-13 12:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知道你标准品total RNA的起始浓度是多大,可以调整到试剂要求的最大量.如果还不行的,只能8倍或者5倍稀释.找个实验手法好的人给你稀释标准品吧.我们实验室有个高手专门稀释标准品,呵呵~而且标准品要现用现稀释.
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发表于 2011-10-13 12:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知道你标准品total RNA的起始浓度是多大,可以调整到试剂要求的最大量.如果还不行的,只能8倍或者5倍稀释.找个实验手法好的人给你稀释标准品吧.我们实验室有个高手专门稀释标准品,呵呵~而且标准品要现用现稀释.
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发表于 2011-10-13 12:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的问题确实太高深了,我不懂.我今天用7000的软件研究研究,我没有7500.然后我们再讨论一下.
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潇湘子[使用道具]
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发表于 2011-10-13 12:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
仪器的使用请您参看说明书吧.ABI的资料我们论坛上都有下载的,呵呵~
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发表于 2011-10-13 12:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有没有人做过多重real-time？做多重需要注意那些问题呢？
模板间的浓度如果不一致，是否会造成竞争？
请各位高手提点~~~~~~~~~~~
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