PCR仪

同楼上的，最近刚刚遇到一件很奇怪的事情，引物用来跑常规PCR，跑胶检测带型和预期相符，无杂带，可是一旦上qPCR，同样的模板和反应条件，出来的结果很乱，34个循环以后起峰，跑胶一看，带型和预期的大小不符，而且呈现拖尾的情况，目前百思不得其解？要命的是每种我都重复了2次，结果还都惊人的相似。难道是染液的问题？可是为什么对别的引物没这种情况发生呢？

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看过你之前对我的一些观点的反驳，但我仍然坚持，仪器的升降温速度对反应缓冲体系的要求是不同的，升降温过程中，反应still working，因此其中是不是有非特异性的退火这些都很难讲。另外，定量和普通PCR的反应条件确实不同，建议你在定量上摸一下条件。还有，一般来说，荧光染料对反应是有阻害的，要不你试试降低一下染料添加量。

同楼上的，最近刚刚遇到一件很奇怪的事情，引物用来跑常规PCR，跑胶检测带型和预期相符，无杂带，可是一旦上qPCR，同样的模板和反应条件，出来的结果很乱，34个循环以后起峰，跑胶一看，带型和预期的大小不符，而且呈现拖尾的情况，目前百思不得其解？要命的是每种我都重复了2次，结果还都惊人的相似。难道是染液的问题？可是为什么对别的引物没这种情况发生呢？

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看过你之前对我的一些观点的反驳，但我仍然坚持，仪器的升降温速度对反应缓冲体系的要求是不同的，升降温过程中，反应still working，因此其中是不是有非特异性的退火这些都很难讲。另外，定量和普通PCR的反应条件确实不同，建议你在定量上摸一下条件。还有，一般来说，荧光染料对反应是有阻害的，要不你试试降低一下染料添加量。

有没有人做过多重real-time？做多重需要注意那些问题呢？
模板间的浓度如果不一致，是否会造成竞争？
请各位高手提点~~~~~~~~~~~

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抱歉，刚刚才看到这个问题。
1。设计：多重PCR的关键就在于引物和探针的设计上。至于设计原则，就不是千八百字能说清楚的了，你可以在网上搜罗一下哈。
2。标记：看你仪器的各个通道之间是否有干扰，这个如果有的话，就属于仪器的硬伤，改变不了，只能避免使用有干扰的通道。

至于您说的模板间的浓度不一致是否会造成竞争，这个问题我没有看懂。一般来说，多重PCR，加的都是同一个样品的total RNA/DNA，只不过同一个管子里检测不同的基因而已。如果您的意思是同一个管子加不同的模板，不同的引物探针，那基本上没必要做多重PCR了。如果指的是，各个样品反应的起始量不同，那就没必要做定量了。定量PCR的第一步，就是尽可能的保证起始量是统一的浓度。

有没有人做过多重real-time？做多重需要注意那些问题呢？
模板间的浓度如果不一致，是否会造成竞争？
请各位高手提点~~~~~~~~~~~

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抱歉，刚刚才看到这个问题。
1。设计：多重PCR的关键就在于引物和探针的设计上。至于设计原则，就不是千八百字能说清楚的了，你可以在网上搜罗一下哈。
2。标记：看你仪器的各个通道之间是否有干扰，这个如果有的话，就属于仪器的硬伤，改变不了，只能避免使用有干扰的通道。

至于您说的模板间的浓度不一致是否会造成竞争，这个问题我没有看懂。一般来说，多重PCR，加的都是同一个样品的total RNA/DNA，只不过同一个管子里检测不同的基因而已。如果您的意思是同一个管子加不同的模板，不同的引物探针，那基本上没必要做多重PCR了。如果指的是，各个样品反应的起始量不同，那就没必要做定量了。定量PCR的第一步，就是尽可能的保证起始量是统一的浓度。