PCR仪

你好，我有个问题：一个炎症发展到肿瘤，经历几个阶段，我要从这几个阶段检测DNA量的变化，可否不用内参，直接把这几个阶段与正常组织所提的DNA进行量的比较呢（定量PCR探针法）？谢谢你！

那有没有必要用目的基因与内参一起做双重PCR呢，还是分开成单管，再进行组与组之间的比较？谢谢！

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希望你能更详细的描述一下实验目的。你是检测引起炎症的病毒从炎症到肿瘤过程中的DNA拷贝数，还是在这个过程中人体组织中某个基因的变化呢？

如果是前者，你应该做绝对定量，基本上不用做内参了，如果是后者，你应该做mRNA起始的相对定量，而不是DNA的变化量。

PS，我确实没弄明白你的实验目的，仅仅靠自己的感觉说了以上的建议。希望对你有帮助。

另外，没必要做双通道的检测，因为双重PCR引物探针的设计很困难。再加上试剂的优化、条件的摸索，花费时间和成本会比单独检测要高出许多。

内参与目的基因是存在竞争关系的，做PCR的时候不仅仅是简单的将两种引物探针混合在一起配成MIX就能出正常的结果的，其中还涉及到引物探针加入量的调整，反应体系的调整，例如模板加入量，等等，等等，这是个特别浩大的工程。如果材料是RNA起始，还要尝试反转录试剂对这种混合的体系的影响，恐怕就不是我们能想像的麻烦了。

如果本着对科学事业的热爱和崇敬，本着对祖国未来医学事业的深谋远虑，而不考虑毕业、经费等等的实际问题，你可以尝试一下。呵呵～

我是用试剂做绝对定量的，我的标准品是质粒DNA,现在做标准曲线出现问题
1）我的曲线直线性不是很好，五个点总是不能很好的分布到一条线上
2）扩增效率很大
3）我不明白根据溶解曲线如何来判断样品的阴阳性结果
4）我的阴性对照的Tm的温度居然跟我的标准品一样，但又没有拷贝数，是不是污染了？

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1. 线性关系不好主要原因就是模板稀释的问题，只能你自己解决了。
2.理论上来讲，扩增效率大于1是表示反应体系有阻害物，需要从提取那步开始改进，但说句实话，这方面的影响绝对没有模板稀释问题的影响大，解决办法参考上述1。
3.溶解温度曲线没有峰，是平滑的，并且也没有扩增曲线和Ct值，就表示没有扩增，更严谨或者说更可靠的办法是把定量的产物跑电泳，没有条带的才视为阴性。因为当有引物二聚体的时候，仪器也会有扩增曲线和溶解温度曲线，此时，不能仅仅靠这两种曲线来判断是不是阴性。
4.如果不是产物和引物二聚体的Tm值恰巧设计成了一样（当然，这种情况又说明引物设计的不合理），那你的实验就是污染了，还是电泳看一下阴性对照有没有目的带吧。

PS 电泳是个很伟大的发明，太万能了。

请教个问题：我知道扩增曲线是跟做正常PCR一样，每个循环检测得到的。
可是溶解曲线怎么得到的？
我看了些资料不知道是不是这样理解的，用SYPR GREEN染料时由于PCR得到了产物，由于SYPR GREEN的非特异性，是要做个溶解曲线的。 该曲线就直接在扩增程序完成后，来个95C, 10min，然后从低温如50C左右，逐渐升温，全程扫描。

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Tm值的定义是DNA的双链解开一半时的温度.SYBR是嵌合在双链里的荧光,制作溶解温度曲线正是利用了这二点.

第一步: 95度高温迅速降到60度或者更低,是为了能让PCR产物双链比较稳定的存在,相当于一个溶解温度曲线制作的准备过程.
第二步:60度缓慢升温到95度,是为了让仪器每个几秒钟就进行一次荧光信号值的检出,双链持续的打开,当解开到一半的时候,荧光信号值达到最大,然后,继续解链,开始降低,直至最后.

请教个问题：我知道扩增曲线是跟做正常PCR一样，每个循环检测得到的。
可是溶解曲线怎么得到的？
我看了些资料不知道是不是这样理解的，用SYPR GREEN染料时由于PCR得到了产物，由于SYPR GREEN的非特异性，是要做个溶解曲线的。 该曲线就直接在扩增程序完成后，来个95C, 10min，然后从低温如50C左右，逐渐升温，全程扫描。

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Tm值的定义是DNA的双链解开一半时的温度.SYBR是嵌合在双链里的荧光,制作溶解温度曲线正是利用了这二点.

第一步: 95度高温迅速降到60度或者更低,是为了能让PCR产物双链比较稳定的存在,相当于一个溶解温度曲线制作的准备过程.
第二步:60度缓慢升温到95度,是为了让仪器每个几秒钟就进行一次荧光信号值的检出,双链持续的打开,当解开到一半的时候,荧光信号值达到最大,然后,继续解链,开始降低,直至最后.