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标题:[精华]】RealTimePCR问题专贴--请先看P1的问题汇总

@木木@[使用道具]
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发表于 2011-10-13 15:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的实验目的：一个疾病从炎症发展到肿瘤，要经历几个阶段， 我是要检测在这几个阶段中某个基因DNA的拷贝数。谢谢你！
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幽兰君[使用道具]
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发表于 2011-10-13 15:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
希望你能更详细的描述一下实验目的。你是检测引起炎症的病毒从炎症到肿瘤过程中的DNA拷贝数，还是在这个过程中人体组织中某个基因的变化呢？

如果是前者，你应该做绝对定量，基本上不用做内参了，如果是后者，你应该做mRNA起始的相对定量，而不是DNA的变化量。

PS，我确实没弄明白你的实验目的，仅仅靠自己的感觉说了以上的建议。希望对你有帮助。

另外，没必要做双通道的检测，因为双重PCR引物探针的设计很困难。再加上试剂的优化、条件的摸索，花费时间和成本会比单独检测要高出许多。
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发表于 2011-10-13 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
他做的是遗传的cnv

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谢谢你，看来我确实是青蛙了，还是趴在井底下的，这就去学习学习，还请幽兰君多指教。  
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douding66[使用道具]
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发表于 2011-10-13 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想做药物对TMV(烟草花叶病毒)-RNA的抑制作用，然后需要对TMV-RNA进行定量。我用的是SYBR GreenII，我不想用绝对定量法，相对定量法需要内参，请问TMV有什么内参基因吗？或者是否可以不用内参，直接用用药物处理过的TMV-RNA的Ct值和未处理过的Ct值直接算抑制率呢？
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发表于 2011-10-13 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用Power SYBR Green PCR Master Mix试剂盒在ABI7000上做实时PCR时，无扩增曲线，奇怪的是用实时PCR的产物跑电泳有特异性的条带。望楼主帮分析一下原因，万分感谢！
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发表于 2011-10-13 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用Power SYBR Green PCR Master Mix试剂盒在ABI7000上做实时PCR时，无扩增曲线，奇怪的是用实时PCR的产物跑电泳有特异性的条带。望楼主帮分析一下原因，万分感谢！

==================================================================================

两种可能：
1。检查仪器的通道有没有选错，SYBR用的是FAM通道。
2。每个循环荧光信号值检出的步骤是在延伸那一步，如果你设置在了变性95度，那肯定不会有什么信号了。
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发表于 2011-10-13 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想做药物对TMV(烟草花叶病毒)-RNA的抑制作用，然后需要对TMV-RNA进行定量。我用的是SYBR GreenII，我不想用绝对定量法，相对定量法需要内参，请问TMV有什么内参基因吗？或者是否可以不用内参，直接用用药物处理过的TMV-RNA的Ct值和未处理过的Ct值直接算抑制率呢？

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我做过烟草叶片的相对定量，用的管家基因是EF1。至于你说的烟草花叶病毒，我没有做过。很遗憾没有帮到你。关于你不使用管家基因，直接对样品定量的方法，其实就是绝对定量。我个人感觉不太适合你目前的实验。一家之言，仅供参考。
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发表于 2011-10-13 15:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
两种可能：
1。检查仪器的通道有没有选错，SYBR用的是FAM通道。
2。每个循环荧光信号值检出的步骤是在延伸那一步，如果你设置在了变性95度，那肯定不会有什么信号了。

=========================================================================================================

FAM 是探针用的通道吧，SYBR只选择SYBR dector 就行了吧 ？

我用的是ABI7000，仪器默认在延伸的一步采集信号，好像不能改 。还有我的熔解曲线是倒立的（峰是往下凸出的），也不知道怎么改过来  
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douding66[使用道具]
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发表于 2011-10-13 15:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
两种可能：
1。检查仪器的通道有没有选错，SYBR用的是FAM通道。
2。每个循环荧光信号值检出的步骤是在延伸那一步，如果你设置在了变性95度，那肯定不会有什么信号了。

=========================================================================================================

FAM 是探针用的通道吧，SYBR只选择SYBR dector 就行了吧 ？

我用的是ABI7000，仪器默认在延伸的一步采集信号，好像不能改 。还有我的熔解曲线是倒立的（峰是往下凸出的），也不知道怎么改过来  
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麻瓜[使用道具]
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发表于 2011-10-13 15:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做过烟草叶片的相对定量，用的管家基因是EF1。至于你说的烟草花叶病毒，我没有做过。很遗憾没有帮到你。关于你不使用管家基因，直接对样品定量的方法，其实就是绝对定量。我个人感觉不太适合你目前的实验。一家之言，仅供参考。

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同意老大说的，这个课题我建议用绝对定量
建立病毒rna的标准曲线，在衡量用药的情况更容易些
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