PCR仪

我想做两个基因在疾病分期中的表达情况并比较。想用探针法做，理由是我 就做两个基因，买探针不会太贵，且特异性好些。目前我的引物已经定了，因为我初次接触实验，很多细节不懂，不 知道应该如何做设计的自己实验，目前我 还没有定RT试剂及PCRMIX等，看 了文献，问了别人，他们说先定RT试剂及定RT试剂及PCRMIXPCRMIX，然后不 加探针，就按普通的PCR做做，看看有无表达，摸摸实验条件，待自己熟悉操作后再定探针，你认为呢？
我明年就要毕业了，好着急，希望得到您的帮助。我的困惑就是：1 针对我的 实验目的，我应该选择什么实验方法（相对定量PCR 探针法？还是.....)能让结果更好更简单更快速呢？谢谢!

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就实验目的来看，想要比较不同时间基因表达变化的情况，你选择相对定量是没有错的，不知道你做的是什么物种，如果不是微生物定量的话，大鼠、猪、人这样的物种，选择SYBR方法不用探针也一样能达到目的。因为现在SYBR方法设计的引物特异性已经很好了，不比探针的方法特异性差。如果你的引物序列已经定了，可以先做定量看看好不好。一般买公司的MIX形式的试剂都有一个推荐的反应条件，基本可以避免大量的摸索条件的时间。

如果你要用探针法的话，就完全没必要先尝试引物好用不好用了，因为探针的设计才是难点，很可能在引物之间根本就找不到探针。请先设计出理论上分析起来很合适的引物和探针再开始买试剂做实验。

还是前几篇帖子说过的问题，探针法，就请用探针法来摸索条件、检测引物探针好用不好用，SYBR法就用SYBR法摸索。用普通PCR检测引物摸条件基本属于浪费时间。当然，这是我个人的经验，也是走了一些弯路后得到的心得。仅供参考。

两种可能：
1。检查仪器的通道有没有选错，SYBR用的是FAM通道。
2。每个循环荧光信号值检出的步骤是在延伸那一步，如果你设置在了变性95度，那肯定不会有什么信号了。

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不知道为什么SYBR要选择FAM通道？FAM不是做探针时用的通道吗 ？

就实验目的来看，想要比较不同时间基因表达变化的情况，你选择相对定量是没有错的，不知道你做的是什么物种，如果不是微生物定量的话，大鼠、猪、人这样的物种，选择SYBR方法不用探针也一样能达到目的。因为现在SYBR方法设计的引物特异性已经很好了，不比探针的方法特异性差。如果你的引物序列已经定了，可以先做定量看看好不好。一般买公司的MIX形式的试剂都有一个推荐的反应条件，基本可以避免大量的摸索条件的时间。

如果你要用探针法的话，就完全没必要先尝试引物好用不好用了，因为探针的设计才是难点，很可能在引物之间根本就找不到探针。请先设计出理论上分析起来很合适的引物和探针再开始买试剂做实验。

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还是前几篇帖子说过的问题，探针法，就请用探针法来摸索条件、检测引物探针好用不好用，SYBR法就用SYBR法摸索。用普通PCR检测引物摸条件基本属于浪费时间。当然，这是我个人的经验，也是走了一些弯路后得到的心得。仅供参考。
yaoshan：你好，我也最近正在准备做real time 呢，看了你帖子的意思是不是说做real time（用syber green）的引物与普通pcr有区别，是否有专门的设计方法，弱弱的问题！

不知道为什么SYBR要选择FAM通道？FAM不是做探针时用的通道吗 ？
望yaoshan兄解释一下，谢谢.....


SYBR与FAM的发射光、激发光波长基本一致，因此，做染料法的时候都选择仪器的FAM通道。

从定量扩增曲线看，是没有任何扩增的，全部都是背景的荧光信号。你的实验电泳有目的带，但却收集不到荧光信号值。此时，又不是我以前描述的两种可能，那只能说明，你忘加荧光染料了。确实没有别的可能鸟～
请你自己看一下仪器的设置吧。

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你好，我也最近正在准备做real time 呢，看了你帖子的意思是不是说做real time（用syber green）的引物与普通pcr有区别，是否有专门的设计方法，弱弱的问题！

定量引物与普通PCR引物设计原则合成级别都是不一样的，定量引物的设计充分考虑了快速升降温的反应条件，因此在某些非特异性反应的控制上，没有普通PCR那么严格，引物的序列也没有普通PCR那么长，这也是为什么不建议大家用普通体系验证定量引物和摸索实验条件的原因。但是定量引物的合成级别高。

SYBR与FAM的发射光、激发光波长基本一致，因此，做染料法的时候都选择仪器的FAM通道。

从定量扩增曲线看，是没有任何扩增的，全部都是背景的荧光信号。你的实验电泳有目的带，但却收集不到荧光信号值。此时，又不是我以前描述的两种可能，那只能说明，你忘加荧光染料了。确实没有别的可能鸟～
请你自己看一下仪器的设置吧。

yaoshan：你好，我也最近正在准备做real time 呢，看了你帖子的意思是不是说做real time（用syber green）的引物与普通pcr有区别，是否有专门的设计方法，弱弱的问题！

定量引物与普通PCR引物设计原则合成级别都是不一样的，定量引物的设计充分考虑了快速升降温的反应条件，因此在某些非特异性反应的控制上，没有普通PCR那么严格，引物的序列也没有普通PCR那么长，这也是为什么不建议大家用普通体系验证定量引物和摸索实验条件的原因。但是定量引物的合成级别高。

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以下的图片是我设置的参数。通道（detector）我只选择了SYBR，你说的FAM没有选，请问这个有问题吗 ？
我是用power SYBR master mix试剂盒做的 SYBR染料等成分都在mix里了，所以不会是没加染料的原因。会不会是染料失效，导致荧光信号减弱呢 ？

注：虽然没有扩增曲线 ，但是熔解曲线是能做出来的