【求助】溶解曲线不好，如何改进？

PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】溶解曲线不好，如何改进？

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】溶解曲线不好，如何改进？

泡泡[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75142
精华 0
积分 225
帖子 189
信誉分 100
可用分 1653
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态离线

发表于 2016-2-9 21:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

溶解曲线不好，如何改进？

附件

2016-2-9 21:02

82332619.snap.jpg (78.09 KB)

泡泡[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75142
精华 0
积分 225
帖子 189
信誉分 100
可用分 1653
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态离线

发表于 2016-2-9 21:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是检测两个目标基因外加一个内参，检测了4个样本，每个反应做两个内参，反应个数是4个样本×3个基因×2个复孔，共24孔，上面的是我的反应溶解曲线，有的还可以，一个峰，有的不行，扩增曲线还好，就是溶解曲线不行，请问怎么改进呢，那些峰是非特异扩增还是二聚体呢？是不是引物不好啊？刚开始做定量，结果不理想，请大家指点，谢谢！

duoduo[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 74511
精华 0
积分 705
帖子 1009
信誉分 100
可用分 5926
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态离线

发表于 2016-2-9 21:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你这个曲线真乱呀，明显有二聚体形成，你先核对你的引物特异性再P；如果引物没有问题，试着提高退火温度可降低二聚体的形成，如果都没有问题，那么可能是基因组有污染

泡泡[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75142
精华 0
积分 225
帖子 189
信誉分 100
可用分 1653
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态离线

发表于 2016-2-9 21:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

"核对引物特异性"就是BLAST一下吧，附件是我的BLAST结果，其中第一、四、五、六、八行是同一物种的一个基因，可以不用考虑，可是第二第三相似性是百分百，有影响吗？第二第三好像是克隆的基因，天然状态下好像不存在吧，我的试验不做克隆请问有影响吗？？？

附件

2016-2-9 21:05

34800329.snap.jpg (16.02 KB)

泡泡[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75142
精华 0
积分 225
帖子 189
信誉分 100
可用分 1653
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态离线

发表于 2016-2-9 21:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

还不知道比对的对不对，新手，请指点，谢谢！！！

redbutterfly[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76433
精华 0
积分 701
帖子 1102
信誉分 100
可用分 6281
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

发表于 2016-2-9 21:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

溶解曲线不好个人认为大部分情况下是产生非特异扩增
1.引物设计稍长一些，如果是RT-PCR引物就设计19bp左右或更长
2.用引物设计软件检测一下引物是否容易形成二聚体，以及是否容易在扩增序列附近产生错误引发。是否blast结果很好个人觉得不是很重要，关键是引物靶位置附近几百bp不要产生低自由能的错误引发。
祝好运！

tianmei001[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 73832
精华 1
积分 585
帖子 806
信誉分 102
可用分 4823
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-28
状态离线

发表于 2016-2-9 21:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

天蓝色那个基因还行，而红色直接不能用要重新设计引物，紫红色有待研究！

tianmei001[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 73832
精华 1
积分 585
帖子 806
信誉分 102
可用分 4823
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-28
状态离线

发表于 2016-2-9 21:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我看也是引物问题，重新设计一下，用Primer3 就行，防止引物二聚体形成！