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标题:【求助】逆转录成cDNA后的产量问题

fox_79[使用道具]
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发表于 2016-2-9 21:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】逆转录成cDNA后的产量问题

如题，我正在做real-time PCR.
总RNA提取后按照２ug的量加入逆转录反应体系（２０ul）．得到的cDNA的量或浓度是多少？是否也是２ug／２０ul？
因为这涉及到后续PCR反应加入多少cDNA的问题．
比较急，非常感谢各位高手的帮助
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wzqzy[使用道具]
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发表于 2016-2-9 21:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也比较困惑这个问题。
咨询了一些人，cDNA用普通的方法没有办法定量（用放射性的什么好像可以）。
所以一般都按照试剂盒的说明书，加入0.2-1.0ul(25ul） 的cDNA
请专家指教！
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lagua123[使用道具]
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发表于 2016-2-9 21:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我一般都是PCR阶段,25ul的体系，加入2ul的cDNA。
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chengjie79[使用道具]
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发表于 2016-2-9 21:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我RNA2ug，RT-PCR时10ul的体系，加入0.3ul的cDNA ,荧光定量时，20的体系0.6ul，结果奇好。
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youreyes[使用道具]
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发表于 2016-2-9 21:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

也一直困惑
我自己做，
RNA提取后，配成1ug/ul标准液，RT时1ul RNA标准液加入20ul RT体系
PCR时，1ul cDNA加入20ul PCR体系
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@木木@[使用道具]
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发表于 2016-2-9 21:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
CDNA里含有RNA酶及抑制剂等会不会影响后续的PCR呢? 我加的RNA绝对量小于1微克,但是我没有调成一样的浓度,所以每个样加的量不一样,定量pcr的时候25ul体系加2ul cdna,这样会不会影响呢?
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bgf5[使用道具]
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发表于 2016-2-9 21:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
9楼
关于这个我最近有个教训
共提取了5个样品的RNA
要做Realtime-PCR，应该是在逆转录时就把RNA总量调到一致
但因为其中有两个样品RNA浓度非常低
总量均不足0.5ug
所以我想把这两组的RNA全部逆转录
PCR时根据cDNA浓度把5组的上样量调为一致就行
其中另外三组的逆转录所用RNA量均为1.5ug
但逆转录为cDNA后，浓度完全乱了
这是RNA浓度，后面两个浓度很低
0.645
0.160
0.481
0.032
0.024
逆转录后测的cDNA浓度为分别为
0.443
0.443
0.788
0.658
0.579
前3个和后2个RNA的量差异有3倍多，但cDNA浓度竟然这么接近，而且后两个比前两个浓度还高，这些值肯定不对！若按照这个浓度上样，actin的CT值肯定差别很大！
关于cDNA的浓度与RNA浓度的关系不知道是否有一定联系，但从上面这个测量值来看，没有什么明显关系，当然考虑还是cDNA的浓度测量不准确。使用分光光度计测量核苷酸浓度，有三个选项，RNA、DNA和oligo，而并无cDNA的选项，我当时选择的是DNA来测量，却得到这样一些奇怪的值，但是不知道使用RNA选项来测量会不会更好，没再试。
因此，最理想准确的选择还是直接在逆转录前就把RNA的量平衡好。
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2016-2-9 21:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

同意楼上的说法。
我们通常说的cDNA一链，实际上是混合物，里面有cDNA、mRNA（Total RNA），还有反转录时的多余的成分。
如果要做定量，可以以Total RNA(或mRNA)的量来定或者以内参做相对定量。
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发表于 2016-2-9 21:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做的是相对荧光定量 .用了看家基因,但是据说还是要平衡CDNA的上样量,所以就测了一下cdna的浓度,总的来说还是和RNA的浓度呈一致变化的, 但是我也不知道应该选ddsdna还是ssdna(分光光度计), 所以两个都试了一下, 结果都有读数,两者差别比较大,
感觉要把cdna调成一样的浓度好麻烦啊,加样管数又多, 不知道有什么好办法没? 是不是一定要cdna上样量一样呢?
另外,就算前面RNA的浓度已经调成一样了, 逆转录后的cdna浓度还是会不一样的, 要是准确的话,还是要测cdna的浓度的
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松子儿[使用道具]
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发表于 2016-2-9 21:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
也不懂这个问题，定量的时候要求CDNA的量，
但是又不知道量Rt之后是多少
以10μl体系为例，加0.3-1的都有，这个怎么确定的？
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