【求助】提RNA加异丙醇后即出现絮状沉淀可能吸入蛋白质...

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标题:【求助】提RNA加异丙醇后即出现絮状沉淀可能吸入蛋白质...

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发表于 2016-2-9 21:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位大虾，请问在提取组织中的病毒RNA时，加异丙醇后即出现絮状沉淀，可能是吸入了蛋白质，还有必要继续往后做吗？还能提得出RNA吗？或者能不能把絮状沉淀低速离心去掉，取上清再接着做呢？请高手指点一二啊！

ha111[使用道具]
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发表于 2016-2-9 21:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做的时候也是加入异丙醇之后立即出现絮状沉淀，我一直以为这是正确的，看了帖子才知道是蛋白质污染，但是我很不明白，我吸取上清的时候很小心，因为怕吸到中间层，所以隔中间层有一段距离的时候我就放弃吸了，这怎么还会有蛋白质污染呢？我的组织倒确实是肝脏的，蛋白含量很丰富。

mybioon[使用道具]
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发表于 2016-2-9 21:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

加氯仿后，并不是所有的蛋白都会到下层或中间层的，
还有一些溶于上层水相（对于蛋白含量高的尤其如此）
即使你没有吸到中间层，加异丙春后还是会有很多沉淀
此时跑电泳时会出现以下现象（如图之右道），甚至比这更遭，只有最前面一条代，还有铁轨样带等现象。不过我没有试过这种RNA能否做RT-PCR

mybioon[使用道具]
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发表于 2016-2-9 21:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

(不知怎的一起发不上，只有分开发了）

附件

2016-2-9 21:48

57231074.jpg (20.97 KB)

eric930[使用道具]
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发表于 2016-2-9 21:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

何必浪费试剂呢？最好不要往下做吧。建议你用氯仿多抽提一下，即吸取上清后再加与前次等量的氯仿，混匀、离心，可以减少蛋白质的污染

utt0989[使用道具]
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发表于 2016-2-9 21:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

天哪！我早没注意到这个问题，还以为有大量沉淀是因为RNA含量很丰富的原因呢！我已经把所有标本的RNA全提出来了。我还没开始测od值和跑电泳，这怎么办？难道提取的都不能用了吗？Sad谁能告诉我，已经用乙醇洗涤过的rna沉淀如果有蛋白质污染，怎么办？有没有办法纯化一下？另外，如果有蛋白质污染，对下一步的反转录以及pcr有什么影响？请大家帮帮我！

nikun230[使用道具]
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发表于 2016-2-9 21:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的试验中也遇到了类似情况，不过加入75％乙醇之后，全部消失了，请教一下各位大侠是怎么回事？

utt0989[使用道具]
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发表于 2016-2-9 21:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

加入乙醇消失？怎么会呢？你是说加入异丙醇后有絮状沉淀，离心有沉淀生成，但是加入75%乙醇洗涤后沉淀都没有了吗？怎么会出现这种情况呢？不可思议，请各位高手指点。

wzqzy[使用道具]
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发表于 2016-2-9 21:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

注意一下乙醇的浓度是否达到75％
我实验室有同学就是没注意这点，沉淀全容了

HP007[使用道具]
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发表于 2016-2-9 21:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位大虾，请问在提取组织中的病毒RNA时，加异丙醇后即出现絮状沉淀，可能是吸入了蛋白质，还有必要继续往后做吗？还能提得出RNA吗？或者能不能把絮状沉淀低速离心去掉，取上清再接着做呢？请高手指点一二啊！

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没有关系的，不就是RNA里面有蛋白吗。
加异丙醇后的沉淀用酒精洗过，晾干，
用适量DEPC溶解，
用你的Trizol（或别的方法）重新提取一遍，
如果你的老板比较财迷，用酚－氯仿重提一遍也可以。
其实过去我们在提取组织RNA时常遇见这个问题，
我们就反复用Trizol－离心取上清－Trizol－离心取上清……
直到中间层没有明显的白膜为止。
也可以用反复酚－氯仿抽提。
对于RNA而言，重要的不是量，而是质。

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