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标题:【求助】请教Real－Time PCR原理

yes4[使用道具]
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发表于 2016-2-9 21:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请教Real－Time PCR原理

请做过Real－Time PCR的大侠，用自己的话，通俗地说一说Real－Time PCR的原理，它和普通PCR的区别，以及它的用途。
多谢。
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remonte[使用道具]
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发表于 2016-2-9 21:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

real-time PCR原理就是通过引入荧光标记能在扩增的每个循环实时的观测到扩增的结果。一般分为染料法和探针法两种。染料法就是在普通的PCR体系中加入适量的SYBR Green染料，利用染料特异性的渗入双链小沟的特性可以实时表征扩增结果；探针法需要根据不同的目的片段设计特异的探针，有TaqMan探针法、分子信标法和FRET法等几种，利用的原理是荧光谐振能量转移。就是利用PCR不同阶段荧光不同变化来检测PCR过程。（原理说来话长，还是建议你看看搜索来的资料后有针对性的提问）
至于区别，普通PCR只能得到定性或半定量的结果（反应一旦达到平台期结果就不可信了），而real-time PCR可以得到定量的结果，实时检测反应的进行，这应该就是最大的区别。
用途多多了，需要准确定量的时候都可以用到它，就不一一列举了。
我有个自己作的入门级的PPT，你如果需要的话把你的电邮PM给我，我给你发一份。
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xyw5[使用道具]
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发表于 2016-2-9 21:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问染料法和探针法那种更好啊，
有的说real time pcr特异性高是由于荧光定量PCR具有引物和探针的双重特异性
染料法也有探针的特异性吗？
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hold住[使用道具]
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发表于 2016-2-9 22:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

SYBR Green 法：
优点
1.对DNA模板没有选择性,适用于任何DNA
2. 使用方便,不必设计复杂探针
3.非常灵敏
4.便宜
缺点
1.容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性 。
2. 但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件。
3. 对引物特异性要求较高
TaqMan探针法 ：
优点
1.对目标序列的高特异性,阴性结果确定。
2.设计相对简单,与目标序列某一区域互补。
3.重复性比较好
缺点
1.只适合一个特定的目标
2.委托公司标记，价格较高。
3.不易找到本底低的探针
SYBR Green 法与普通的PCR没什么区别，就是加了SYBR Green ，其特异性与普通的PCR一样。
在real time PCR中TaqMan探针法，可以说具有引物和探针的双重特异性，而
SYBR Green 法没有双重特异性。
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vcve[使用道具]
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发表于 2016-2-9 22:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。染料法没有探针的识别步骤，所以特异性不够高，但是简便易行.我没做过探针法,我的实验用得是SYBR Green 法.个人认为又便宜又简便.如果用全套的试剂盒的话,会更加便利.
SYBR Green I 在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链 DNA 相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。利用荧光染料可以指示双链 DNA 熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以、区分非特异扩增，进一步地还可以实现单色多重测定。此外，由于一个 PCR 产物可以与多分子的染料结合，因此 SYBR Green I 的灵敏度很高。但是，由于 SYBR Green I 与所有的双链 DNA 相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响 。
实时定量 PCR 实验设计和数据分析可以采用相对定量和绝对定量两种方法,我采用的是相对定量方法,可以用2 -△△CT 方法分析相对基因表达差异.
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发表于 2016-2-9 22:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

目前荧光PCR主要有几种：TaqMan法（ABI公司专利）、分子信标法（molecular beacon）、双杂交探针FRET法（Roche公司专利）以及通用模板信号扩增技术（UT-PCR）、SYBR green等。都是基于荧光能量共振原理，利用DNA变性、复性或引物延伸使特定波长的荧光产生或淬灭，从而把是否发生了PCR反应与荧光变化关联起来，在全自动荧光PCR仪中实现PCR反应和实时监测。
不知道阁下要了解哪一种？
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milkdog[使用道具]
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发表于 2016-2-9 22:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问taqman探针和反应引物有无特殊要求,比如两者的反应条件等.
使用taqman的话是自己设计引物和探针好,还是由ABI设计合成好呢,因为有朋友说自己设计的引物不一定和ABI的taqman探针相适应.烦请解释,谢谢
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发表于 2016-2-9 22:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

TaqMan探针一般用两步法的居多，没什么特殊要求。
现在公司都免费设计探针或引物，一般我都委托他们一起设计探针和引物，效果可能会好一些。
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发表于 2016-2-9 22:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

想咨询一下双杂交探针FRET法（Roche公司专利）的探针可以在哪里定啊，网上找了好久都找不到。
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