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标题:【求助】pcr后跑电泳非特异性条带很多怎么办？

了了[使用道具]
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发表于 2016-2-9 22:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】pcr后跑电泳非特异性条带很多怎么办？


pcr后跑电泳我要的条带很亮，但同时非特异性条带很多，提高退火温度后，也不能消除。请教各位我该如何处理？
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发表于 2016-2-9 22:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
看你接来要做什么？也不一定非得消除非特异的条带
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泡泡[使用道具]
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发表于 2016-2-9 22:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你可以试着调整一下镁离子的浓度，最好是做一个梯度，同时应该提高退火温度，这样看看行不行。
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了了[使用道具]
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 小中大

我接下来要酶切，是一定要把目的基因前面的条带消除的。提高温度我也做了，只是温度提高后，目的基因和杂带有很模糊，什么也看不见了，很是郁闷！
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kulee[使用道具]
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发表于 2016-2-9 22:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
看来要用降落（TD）-PCR了，就是PCR开始时的退火温度高于Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到Tm值并最终低于这个水平。首先在高于引物Tm值的温度扩增几个循环，然后把退火温度逐渐降到两引物的Tm值附近，在随后的循环中，对退火温度进行梯度实验。这样能保证第一引物-模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何级扩增，在剩下的循环中处于超过任何非特异PCR产物的地位。因此，TD-PCR既能增加反应特异性，又能提高PCR产物的产量。
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发表于 2016-2-9 22:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
特异带切胶，作pcr模板试一下！看看有没有多余带
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66小飞侠[使用道具]
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发表于 2016-2-9 22:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 了了 于 2016-2-9 22:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我接下来要酶切，是一定要把目的基因前面的条带消除的。提高温度我也做了，只是温度提高后，目的基因和杂带有很模糊，什么也看不见了，很是郁闷！ ...

首先要确定你酶切的目的，是继续做载体连接还是不继续做了，仅仅进行酶切与否的分型。
如果是前者，估计你的样本量应该不多，控制PCR的总量和特异条带的最高亮度的条件，然后进行切胶回收就可以了。
如果是后者，可能相对样本量多一些。都采用切胶回收的方法固然不现实，那我觉得你不妨先不要着急想去除干净非特异性的条带，要想两全其美，起始显示中是比较困难的。你可以尝试用你需要的酶进行酶切，看看酶切后的残余片断是否会由于非特异性扩增而有质的影响。往往，非特异性扩增产物不能被酶切，或者酶切后残余条带明显偏离你需要关注的范围，那样的话是不干扰你进行基因分型的。如果需要回收片断的话，这个时候进行切胶也不晚。
如果确实酶切后，杂带在分子量范围和亮度上都明显干扰目的条带的话，那非常不幸，你必须仔细摸索PCR条件了。
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发表于 2016-2-9 22:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以试试stepdown-PCR, 逐级降低退火温度，我试过从70度开始，每3个循环降2度，直到最佳退火温度，我的是60度。同时把退火和延伸时间都缩短一点，我试过15秒，效果还不错。
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yyaxw84[使用道具]
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发表于 2016-2-9 22:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

也可以直接将目标带回收，然后再作后面的实验。这样非特异性带也就无所谓了
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了了[使用道具]
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发表于 2016-2-9 22:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我酶切是最后的一步.由于做基因多态性,所以样本数目较大,有500个左右.我也考虑过回收胶,但是费用太高.
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