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标题:【求助】请问RT-PCR提出总RNA后能否跑琼脂糖电泳检测

minran_1980[使用道具]
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发表于 2016-2-10 14:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请问RT-PCR提出总RNA后能否跑琼脂糖电泳检测

各位好
请教一个问题,我做RT-PCR,在提取到总RNA后,逆转录之前,
我想跑一个琼脂糖电泳,检验一下RNA有没有提出.
今天刚跑完一个,第一次,只看到了泳道,没有带
请各位大侠帮忙解释一下,是何原因?
因为我在制胶和配缓冲液时所用的液体都没有进行灭RNA酶处理,
这会不会影响结果,比如把RNA 分解了?还有琼脂糖的浓度有具体要求吗?
谢谢
另外,在水溶RNA时,因为没有去离子的DEPC水,我自己用双蒸水和DEPC配置的,这会不会对RNA或电泳产生影响?
谢谢
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yapuyapu[使用道具]
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发表于 2016-2-10 14:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果你只是希望看一下RNA的质量,强烈建议仅做普通琼脂糖电泳,采用0.5*TAE的1%普通琼脂糖电泳(同常规凝胶)在1*TAE电泳液中电泳效果很好,28S,18S和5S非常清楚,而如果降解,也非常明显,而且偶做时直接在凝胶中加EB,不会影响观察结果,屡试,保证没问题,ABSOLUTELY!不过请不要重复使用电泳液.而且液体最好是用DEPC H2O比较安全.但是如果要做NORTHERN,那还是请老老实实地配甲醛变性胶.
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qqshepherd[使用道具]
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发表于 2016-2-10 14:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我就是直接用TAE琼脂糖电泳直接跑，先看一下18s和28s，比变性甲醛电泳还好，条带清晰。但不可在胶里直接加EB，可以在上样时在样品中加，否者看不清。
双蒸水和DEPC足够了，我就用蒸馏水和DEPC。再来试试，可能是 RNA量不够。
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xevin[使用道具]
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发表于 2016-2-10 14:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
先看一下18s和28s，比变性甲醛电泳还好，条带清晰
乖乖！看来编书者是在梦中想到变性甲醛的？
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minran_1980[使用道具]
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发表于 2016-2-10 14:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
记得在同学录中看到Fang CY是山东人吧。偶也是。现在青岛医学院读研。
我有跑了一次，加了四份样本，每份3ul+3ul溴酚蓝，150V电泳，1XTBE缓冲液，1%胶。结果发现，有涌道，但涌道中没发现带。比较奇怪的是，在四个加样孔内都有一条明显的细条带，问过一个老师，他确定是带，但也没能解释原因。如果是带的话，意味着RNA在孔中没有跑出来？为什么有这种现象？
是不是我的胶浓度不合适？
另外，我刚刚做RT-PCR，不知道你们说的“先看一下18s和28s”是什么意思？该怎样看？
请Fang CY和redsun能继续给予帮助和指点。
感激。
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wanglaoshi[使用道具]
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发表于 2016-2-10 14:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

关于加样孔中的细带，可能是基因组DNA。建议你还是麻烦点用变性甲醛电泳RNA。请到下面的帖子处看一下。
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=403521&sty=1&tpg=3&age=0')
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finger[使用道具]
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发表于 2016-2-10 14:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

提取的总RNA在跑电泳时应该有三条带，分别是28s,18s,5s，如果RNA提取的好，电泳结果中28s：18s应该约为2：1，看一下18s和28s的意思是为了检测提取的RNA是否降解。
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发表于 2016-2-10 14:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也是直接用跑dna的电泳液跑rna的，目的是在northern之前看是否有rna降解（观察18s和28s的比例），特比好，没问题，看18s和28s，但作northern不行，1需要甲醛变性才能保证其无二级结构，才能正确的看其分子量的大小，2甲醛可交连蛋白，是RNase失活，防止rna降解。
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发表于 2016-2-10 14:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以试试分子克隆3的戊二醛电泳
比甲醛好闻
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youreyes[使用道具]
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发表于 2016-2-10 14:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有泳道，没有条带可能RNA降解很多造成的。在做提取过程中所有用到的仪器及溶液最好用DEPC水浸泡过夜。
你第二次跑胶时在样孔中出现的细条带可能不是核酸，是其它的什么杂质。
跑胶检测一下总RNA是否完整提出，18s和28s及5s三条带清晰可见可以佐证你提取得较成功。
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