【求助】如何扩增启动子序列 - 经验共享

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标题:【求助】如何扩增启动子序列

bring[使用道具]
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发表于 2016-2-10 17:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我最近用PCR法扩增了一段启动子序列，谈点体会供参考
1）采用多重PCR
2）用了LA酶或KOD-PLUS
3）8%DMSO+5%甘油
4）基因组DNA的加入量：1-10ng

wzqzy[使用道具]
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发表于 2016-2-10 17:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我现在正在做Streptococcus gordonii（戈登链球菌）rgg/IgG启动子的PCR，我设计的引物为：
上游（F）： 5'-CGCGGATCCTTTTATTGACGGAGATTAGC-3'
下游（R）： 5'-CGCCTCGAGATTGGTCACTTGATTAGC-3'
其中能与模板连接的部分是CTTTTATTGACGGAGATTAGC和ATTGGTCACTTGATTAGC，其余的部分是酶切位点和保护碱基。
从NCBI找的这段基因的序列见附件。
请问我的引物对扩增这个启动子是否合适？我的扩增程序应该怎么设计？
因为我用退火温度60℃和58℃一直没有P出来。

@STAR@[使用道具]
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发表于 2016-2-10 17:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

一直忙着做实验，现在很少来园子里了。今天是准备给老板发E-mail,在收件箱里看到回复通知,才知道还有战友在观注这个贴子.那么我就汇报一下我的结果.
我现在已经得到了大小相符的条带,但条带很淡,回收后量太少,没法直接测序鉴定.准备用T-载体连接,大肠杆菌扩增后测序,但是目前实验室T-载体出了问题,大家都连不上去,已经订了新的T-载体,就快到货了.
我用的是LA酶和配套的GC buffer.
反应条件：变性温度——94℃(首次为95℃），时间——1min
退火温度——56℃(比引物的退火温度低10℃)，时间——1min
延伸温度——72℃，时间——2min
上下游引物长度分别为30和29bp
根据上述反应条件进行实验时，结果并不稳定，多数情况下没有条带或条带太淡，没法回收，十次实验能得到较亮的可以回收条带的次数不超过两次。可能反应条件还需要近一步优化。
体会是PCR反应太不确切，付出极大努力，回报却很难令人满意。我已近乎绝望。以后做实验能不做PCR则绝不做PCR。
祝苦海中的兄弟们好运。

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