小中大谢谢4楼～
上个实验最近停了一段时间
第一次的RNA提取也是用 ABI的试剂盒 不过样本细胞是放在TRZIOL中，不能适用那个盒子。
现在我重新养了细胞用Trizol法提取总RNA
用ABI的盒子反转录,程序如下：
100mM dNTPs (with dTTP) 0.2ul
MultiScribe? Reverse Transcriptase, 50 U/μL 1ul
10? Reverse Transcription Buffer 1ul
RNase Inhibitor, 20U/μL 0.13ul
RT Primer for mir-122a, 181a, u6b 3ul (1ul each)
RNA (10ng/ul) 3ul
水 1.67ul
Total 10ul
Then reaction in the following condition: 16°C, 30min; 42°C, 30min, 85°C, 5min. HOLD ∞ 4°C.
PCR amplification:
PCR Reaction:
TaqMan MicroRNA Assay (20?) 0.5 ul（探针减半用）
模板： 2ul稀释液 （原液稀释10倍）
PCR Mix（自己配的 Mg 2.5mM） 10 ul
水 7.5 ul
Total Volume 20 ul
PCR：
95度 5min
95度 10s 40cycles
60度 60s
40度 1min
最近一次做了几个处理样本的 U6 内参 Cp值 在26左右 电泳条带大小在 100bp左右。
请问大小是否正常（几乎没有拖带）
等处理好样品预实验后再贴图请教。
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你好，请问探针为什么要减半用。我目前只做了反转录，就是完全按照说明书上的剂量加的，可以吗？
