【求助】疑问求助

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标题:【求助】疑问求助

气泡[使用道具]
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发表于 2016-2-29 15:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我现在在扩大片段的,大约15kb左右,每次结果都是这样,虽然出现了目的带,但老是条带呈现这种冲击扇形状,是不是是非目的产物,还是其它的什么原因.还有就是点样孔亮,这是形成的大的非特异性产物吗.
请大家赐教!
thanks!

附件

2016-2-29 15:26

31526197.jpg (22.67 KB)

四福晋[使用道具]
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发表于 2016-2-29 15:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

是不是模板浓度过高！

气泡[使用道具]
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发表于 2016-2-29 15:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

模板我是0.1ug/ul,加的0.5ul.
应该不会有问题吧^^^

junjie05[使用道具]
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发表于 2016-2-29 15:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可能是跑电泳的电压过高

气泡[使用道具]
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发表于 2016-2-29 15:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

低电压跑过的,经常也会是这样,

koook5695[使用道具]
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发表于 2016-2-29 15:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可以降低模板量,加样空里应当是污染的蛋白!

气泡[使用道具]
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发表于 2016-2-29 15:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼上的能否给点再具体的指点,污染的蛋白一般是怎么进入的,模板污染,还是在加样过程中有污染,或者是其它?
我分析我的模板应该没有污染,买的现成的,质量应该是有保证的.试剂都是用纯水配的.
欢迎各位园友积极参加讨论,十分感谢!!

乌贼老弟[使用道具]
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发表于 2016-2-29 15:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

曾经也疑惑过这个问题,现在说说自己的看法
从你的电泳图看,你所说道的冲击扇形状条带,MARKER 同样是这样的啊,可以肯定是胶的问题了,你跑了好多次,都是一样的效果应该不是琼脂糖的问题,该怀疑的就只有缓冲液了,不知道你有没有换新的缓冲液试试,缓冲液跑的时间用的时间太长,更容易变热,且其离子浓度,PH值都会发生变化的.我曾经做过实验,新的缓冲液可以减少"变形"的力度.但是不能变的很平直,我做比较的时候,别的产物可以很平直,唯就某个产物不可以,这说明这个PCR产物的空间结构比较特异吧,具体什么原因就不知道了.
至于你孔里的亮带,应该是蛋白污染.蛋白污染的表象就是这样啊,跑不出孔,且会吸附在孔周.蛋白可能来自DNA抽提过程中,去蛋白不够完全,RT得到的CDNA同样也是可能有蛋白存在的,这与标本的处理措施及抽提的试剂及人员操作等都有关系,不要太相信花钱的就是好货哦

leifengta[使用道具]
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发表于 2016-2-29 15:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

根据自己的经验，我认为出现这种情况的常见原因有：
1、电泳温度过高：建议在低温（60－100°C）下进行凝胶电泳；
2、电泳液有效成分失效：换新配制的电泳液；
3、样品上样超载：减少模板DNA的量或在扩增样品和载样缓冲液混合前对样品进行稀释；
4、凝胶质量差：使用高质量的凝胶可减少脱尾的量；
5、凝胶配制操作不规范：配制凝胶过程中，拔梳子时用力不均匀，造成梳子空不规整，这样也会影像跑教效果；
根据你自己的情况，可以考虑逐条核对
至于加样空亮，我觉得不外乎是你扩增的模板量大或者浓度过高，要么就是如楼上所说是蛋白污染了

气泡[使用道具]
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发表于 2016-2-29 15:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢各位的积极参与，从大家的分析中，收获不少。
我各人还有一种分析，就是我扩增的是大片段的，会不会是扩增过程中有较大的，较杂的片段生成了，所以在胶孔里跑不出来。
我新贴图大家看看，若是在PCR时添加了甜菜碱的话，点样孔会好很多的，这样是不是可以排除是蛋白污染。

附件

2016-2-29 15:30

20647637.jpg (21 KB)

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