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标题:【求助】MSP的阳性对照问题

yychen[使用道具]
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发表于 2016-2-29 17:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你做的过程顺利吗？亚硫酸氢钠变性是用的哪个公司的什么试剂盒，我买的QIAGEN的，现在还没送过来，不知道效果怎么样
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发表于 2016-2-29 17:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
也不顺利，刚开始做，现在是第三周，第一次PCR跑电泳阳性对照倒是有目的条带，后来重复了三次都没有。现在正一步步排除问题，感觉DNA纯化过程中DNA丢失很厉害，第一次做时用的是MN的，最近用的是天为时代的，修饰完后不进行PCR，直接跑电泳，看不到条带。我也没有糖原，没办法示踪。我是手工做的，没用试剂盒，据说Chemicon的不错，我也了解过QIAGEN的，有个新产品用来做修饰加纯化的，时间只需6小时，应该不错。你买的是那个吗？开始使用后如果结果不错，请告知我，一起交流。
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发表于 2016-2-29 17:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的试剂盒到了，但是PCR拿出来跑胶，一片空白，不知道哪个地方出了问题，是不是模板太少了，用QIAGEN的试剂盒变性，拿出来测纯度怎么是3.6217阿，我的PCR反应体系：sense primer 1ul
antisense primer 1ul
dna 100ng
buffer 5ul
dNTP 5ul
hotstar(2.5u/ul) 1ul
ddH2O 27ul
请帮忙看一下，有没有问题？谢谢
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发表于 2016-2-29 17:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上90%的可能性是模板量过大,减少模板试试,如果还不行就可能是引物的问题了
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yychen[使用道具]
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发表于 2016-2-29 17:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的QIAGEN的变性的试剂盒，效果还可以，跑出了阳性条带，但是正常对照怎么也有条带阿，还有几条非特异性条带，还得摸下条件
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发表于 2016-2-29 17:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我现在做BSP，我设计的引物都要放2轮才能看到条带，我是用PerlPrimer设计的，我不知道是不是引物设计上有问题还是模板损失太厉害，我的引物TM相差2度（软件给的），我是手工修饰的。
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发表于 2016-2-29 17:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的试剂盒到了，但是PCR拿出来跑胶，一片空白，不知道哪个地方出了问题，是不是模板太少了，用QIAGEN的试剂盒变性，拿出来测纯度怎么是3.6217阿，我的PCR反应体系：sense primer 1ul
antisense primer 1ul
dna 100ng
buffer 5ul
dNTP 5ul
hotstar(2.5u/ul) 1ul
ddH2O 27ul
请帮忙看一下，有没有问题？谢谢
......

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亲，后来你的体系怎么改啦？我现在做出来和你这个一样，能请教一下么？
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发表于 2016-2-29 17:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教一下，您是怎么做阴性对照的呢？
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