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标题:【求助】降落PCR与热启动

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发表于 2016-3-1 11:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】降落PCR与热启动


各位大侠:
1:我最近正在做RT-PCR,可是一直没有结果,有人建议用降落PCR.,请教降落PCR必须与热启动联合才能做吗?如果必须用热启动那普通的Taq酶可以吗?有人说可以在预变性后再加酶,这样做可以吗?
2另外,做RT是我用的是AMV请问RNA的量要加多少?说明书上说是1微克这里指的是总RNA 还是mRNA,我提组织后测RNA浓度为3.5微克/微升,做RT时要加多少RNA?RNA需要稀释吗?稀释成1微克/微升?然后取1微升?
急盼回复!先谢了!
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发表于 2016-3-1 11:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我只能回答第一个问题——做热启动可以用普通Taq酶，也可以用更耐热的酶。我试过直接加酶，再变性，也能做出来。可能我的基因比较好拉吧。
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发表于 2016-3-1 11:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1/ 热启动要用专门的热启动酶，即Taq HS.热启动酶是酶和抗体的混合物。在升温的过程中酶和抗体保持结合状态，直到变性温度抗体失活，酶才开始反应。因为防止了开始升温过程中酶就开始反应，热启动可以大大降低非特异性扩增。在预变性后再加酶也可以，但效果肯定没有用热启动酶好。很多公司的酶都有相应的热启动酶版本，价格大约是对应非热启动酶的一倍。用降落PCR最好与热启动联合。
2/ 1微克这里指的是总RNA 还是mRNA都有可能。一般体系模版要求total RNA<=2ug，mRNA<=1ug。至于模版的下限取决于你的试剂盒的性能。你的RNA浓度为3.5微克/微升不用再稀释，在反转录过程中加水调到你要的模版浓度和总体积即可。如果你要用的方便，可以稀释成1微克/微升。
3/ 好运气。
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发表于 2016-3-1 11:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上的不妥吧？
没有听说过中途（预变性后）加酶也叫热启动？
另外，降落PCR一定要用热启动，否则就失去降落的意义了 ！
我是多专门的PCR技术指南是看的，自己也做过热启动，当然最好是用专用的热启动酶，省事！
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气泡[使用道具]
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发表于 2016-3-1 14:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢三位!我做RT-PCR已经快三个月了,一直做不出来,想了很多原因.考虑过可能是RT时RNA加的太多,所以想稀释一下RNA再做,不知RNA多了是否会影响后续PCR?
有人建议我做降落PCR,我用普通的酶做的,结果连杂带都没有,更不用说目的基因了.只有前面一团似乎是引物二聚体.真是郁闷呀!怎麽连非特异带都没有呢?
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发表于 2016-3-1 14:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

试试跑个mg梯度
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发表于 2016-3-1 14:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的情况和楼上完全一样，郁闷中，已经不知道该怎么变条件了，即盼回复，另外我还想问做一步法RT-PCR怎么做热启动？谢谢
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发表于 2016-3-1 14:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
各位大侠:
1:我最近正在做RT-PCR,可是一直没有结果,有人建议用降落PCR.,请教降落PCR必须与热启动联合才能做吗?如果必须用热启动那普通的Taq酶可以吗?有人说可以在预变性后再加酶,这样做可以吗?
2另外,做RT是我用的是AMV请问RNA的量要加多少?说明书上说是1微克这里指的是总RNA 还是mRNA,我提组织后测RNA浓度为3.5微克/微升,做RT时要加多少RNA?RNA需要稀释吗?稀释成1微克/微升?然后取1微升?
急盼回复!先谢了!
1,降落PCR不必要非和热启动联合在一起.用普通TAQ酶当然可以热启动,和耐热酶没什么区别.
2,我想应该是总RNA,一般情况下没有特别要求,RNA分析只需要提取总RNA,按你的浓度我认为加1-2ul,不需要稀释成1ug/ul
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气泡[使用道具]
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发表于 2016-3-1 14:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1我想问如果不稀释,加1-2ul,那不是有3.5-7ug吗?可amagic
说一般体系模版要求total RNA<=2ug，mRNA<=1ug。这样会不会太多?
2用普通酶如何做降落PCR?需要在预变性后加酶吗?
谢谢!!!
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气泡[使用道具]
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发表于 2016-3-1 14:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
普通酶加的时候在第一轮循环中向变性温度升温过程中达到65~70度时再加Taq酶,不过这种方法只适合对少数几个样本进行操作.另一种方法时用石蜡分层,将反应成分用石蜡分成上下两部分,当温度上升后将石蜡熔化,两部分成分混合,成为完整的反应体系.
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