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标题:【求助】荧光定量溶解曲线

junjie05[使用道具]
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发表于 2016-3-1 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】荧光定量溶解曲线


最近在做荧光定量，是个新手，还请各位做过此类实验的师兄师姐帮忙看看我的溶解曲线，第一张图是目的基因的，第二张是内参的。目的基因是双峰，后来根据相关资料说引物浓度较高的问题，自己做了引物浓度梯度（终浓度分别是0.2μM,0.25μM,0.3μM），还是有双峰；而且内参基因的溶解曲线虽然是单峰，但是峰值处的Tm值不相同，这是怎么回事？还请各位帮帮忙！谢谢谢


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45778[使用道具]
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发表于 2016-3-1 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主，你的引物浓度还是太高了，引物终浓度0.1uM至1.5uM做下实验。
再请问下，你实验用的反应条件是怎么样的？
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发表于 2016-3-1 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 45778 于 2016-3-1 16:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主，你的引物浓度还是太高了，引物终浓度0.1uM至1.5uM做下实验。
再请问下，你实验用的反应条件是怎么样的？

第一次做这个实验，我是按照TAKARA的荧光定量说明书上配制的体系，引物浓度是0.4，后来的做的是0.2,0.25和0.3μM的，不好意思之前写错了。反应条件是：95℃，30s；（95℃，5s，52.8℃，30s）*40；因为老板设计的引物的Tm值都在52.8左右，所以就选择了这个温度；后来又做了一个退火温度是60℃的，目的基因还是双峰！
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发表于 2016-3-1 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

（1）内参Tm值不一致的现象，在实验中尚未有发现，不知何解。如果可以，建议把那几个Tm不一致的PCR产物送测序，进行序列分析，找到原因；
（2）目的片段出现双峰，首先，分析下你的序列，引物扩增的片段是不是存在有片段缺失的情况；第二，非特异性扩增，需要继续提供退火温度（大于60度），要么只能重新比对下序列，再进行引物设计。
（3）预测下你产物的Tm值，这两个基因的Tm值比较接近，实验操作时引物的相互污染或者加错引物或者标识错误也会产生上述的结果。
暂时想到这么多。
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发表于 2016-3-1 16:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

怎么不见阴性对照呢？如果阴性对照里没有这个峰，基本可以排除引物浓度问题了
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发表于 2016-3-1 16:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
没有做阴性对照。如果要做阴性对照的话，是不是内参和目的基因这两个引物都要做阴性对照？而且阴性对照也需要三个重复吗？第一次做定量，还请大侠多多指点！
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发表于 2016-3-1 16:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 junjie05 于 2016-3-1 16:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
没有做阴性对照。如果要做阴性对照的话，是不是内参和目的基因这两个引物都要做阴性对照？而且阴性对照也需要三个重复吗？第一次做定量，还请大侠多多指点！ ...

最好是两个基因的引物都做个阴性对照，不过如果孔不够的话可以先只做目的基因的，看看会不会有峰
阴性对照做一个就可以了
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发表于 2016-3-1 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
估计楼主的阴性对照会出现一个Tm在85左右的峰。
我先回答第二个问题：内参基因峰值处的Tm值不相同，是因为扩增后的产物不纯，里面不但包含有目的基因(目测Tm在87左右)，同时还有引物二聚体（目测Tm在85左右）。当两者比例发生变化时，溶解曲线的峰值Tm值也随之变化，会在87-85之间摆动。
出现引物二聚体可能原因：
1）引物浓度过高=解决方法：调整浓度
2) 引物设计的缺陷=解决方法：重新设计
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45778[使用道具]
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 小中大


QUOTE:
原帖由 555444 于 2016-3-1 17:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
估计楼主的阴性对照会出现一个Tm在85左右的峰。
我先回答第二个问题：内参基因峰值处的Tm值不相同，是因为扩增后的产物不纯，里面不但包含有目的基因(目测Tm在87左右)，同时还有引物二聚体（目测Tm在85左右）。当两者比例发生变 ...

请问内参基因峰值处Tm值不同这个问题有没有解决的办法呢？谢谢!
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 小中大
降低引物浓度，提高退火温度！
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