【求助】请帮忙溶解曲线分析

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标题:【求助】请帮忙溶解曲线分析

穿越时空[使用道具]
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发表于 2016-3-3 10:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用的染料做QPCR，为什么每次的结果都很不平滑？信号似乎也不强。伯乐的机器，请帮助优化一下好吗？普通PCR没有非特异扩增。很清晰的没有。

toy[使用道具]
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发表于 2016-3-3 10:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

百乐的机器最好选用百乐的试剂。看看有没有引物二聚体

october7[使用道具]
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发表于 2016-3-3 10:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这个熔解曲线还是不错的，单峰并且峰宽度比较小，已经可以接受了。
至于信号平滑的问题，可能是因为仪器判断、拟合信号的方式不同造成的。用另一种仪器也许能拿到更好的结果。最好你能发一下扩增曲线，利于大家更全面的分析你的结果。

xue258[使用道具]
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发表于 2016-3-3 10:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

单说溶解温度曲线，还是很不错的。谈不上十分的不平滑，仪器有波动是必然的。没用过伯乐的机器，可以看一下仪器说明书，看看是专用的校正液还是用ROX校正。个人觉得你校正一下仪器，应该会获得好一点的结果。
赞同楼上战友的建议，还应该看看你的扩增曲线，如果扩增曲线的平台期是光滑的，那你这组定量结果是可以用的。不必苛求太高。

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发表于 2016-3-3 10:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 october7 于 2016-3-3 10:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
这个熔解曲线还是不错的，单峰并且峰宽度比较小，已经可以接受了。
至于信号平滑的问题，可能是因为仪器判断、拟合信号的方式不同造成的。用另一种仪器也许能拿到更好的结果。最好你能发一下扩增曲线，利于大家更全面的分析 ...

请看我的扩增曲线

附件

2016-3-3 11:00

50382567.jpg (71.58 KB)

october7[使用道具]
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发表于 2016-3-3 11:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

扩增出现的比较晚了，而且扩增曲线不平滑。也许是因为体系中荧光信号不稳定造成了扩增曲线和熔解曲线不平滑，请改进扩增体系，或者用阳性对照进行实验验证。

穿越时空[使用道具]
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发表于 2016-3-3 11:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 october7 于 2016-3-3 11:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

扩增出现的比较晚了，而且扩增曲线不平滑。也许是因为体系中荧光信号不稳定造成了扩增曲线和熔解曲线不平滑，请改进扩增体系，或者用阳性对照进行实验验证。 ...

请教优化的方向

october7[使用道具]
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发表于 2016-3-3 11:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

退火温度，模板质量等等……

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发表于 2016-3-3 11:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你用的仪器好像不是IQ5，感觉荧光信号整体比较弱，你可以把定量PCR的产物跑一下电泳，如果条带不清楚，说明扩增不好，改变条件重做；如果条带单一而且很亮，可能是你的PCR管透明度不好，或者SYBR green I 有问题，还有可能是仪器信号采集不好。

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