小中大我感觉引物设计不能没有软件帮助也没有完全依赖软件。
设计引物的时候最好能针对保守区，即使你手里的毒株跟GeneBank 上的毒株名一样，它们的序列也可能不同，所以就需要Blast，也可以用Bioedit ，比较起来很方便。
根据你的需要选择好不同长度的保守区，长度还是短一点比较好，我感觉15－35bp 比较容易成功。另外，如果找不到完全保守的一段长序列，只要3‘端有8个bp 完全保守也是可以P出来片段的。在5’端可以加上一些酶切位点或调GC比。加酶切位点之前用软件看看目的片段本身有无你要加的酶切位点，如果有的话要避开。用primer就可以解决，oligo也可以。设计完之后呢就可以用软件看看有无发夹，二聚体，非特异性结合以及GC％，TM值等。用Primer 就可以解决了，用pcrdesn也可以。
