求助引物设计的战友先进来这里~~~~~~· - 经验共享

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标题:求助引物设计的战友先进来这里~~~~~~·

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发表于 2011-10-19 12:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请各位高手帮我看一下，我设计的这个引物能行吗？
谢谢！！！
SIRT1
AGACAACCTC CTGTTGGCTG ATGAGATCAT CACTAATGGC TTTCATTCCT
GTGAAAGTGA TGACGATGAC AGAGCATCAC ACGCAAGCTC TAGTGACTGG
ACTCCAAGGC CACGGATAGG TCCATATACT TTTGTTCAGC AACACCTCAT
GATTGGCACC GATCCTCGAA CAATTCTTAA AGATTTATTA CCAGAAACAA
TTCCTCCACC TGAGTTGGAT GATATGACAC TGTGGCAGAT TGTTATTAAT
ATCCTTTCAG AACCACCAAA GCGGAAAAAA AGAAAAGATA TTAATACAAT
TGAAGATGCT GTGAAGTTAC TACAAGAGTG CAAAAAGATA ATAGTTCTGA
CTGGAGCTGG GGTTTCTGTT TCCTGTGGGA TACCTGACTT CAGATCAAGA
GATGGTATTT ATGCTCGCCT TGCTGTGGAC TTCCCGGATC TCCCAGATCC
TCAAGCCATG TTCGATATTG AGTATTTTAG AAAAGACCCA AGACCATTCT
TCAAGTTTGC AAAGAAGAAA CAGCATTGAA GCATTATTTG GGGGGAAAAA
CACACACACA AAATCCAGCA ACTCAGCATT CATGAGCAGC TCTGTTCTAT
ACCAGTATGT GCCTGTGCAG TGGAAGGAAA GCAATTTTGG
我设计的是Antisense GGCGAGCATAAATACCAT
Sense AACCTCCTGTTGGCTGAT

NMNAT1
1 gtctcctgga ggactagggc cgtttggcct tcacggcctg acaacaacat cggcatcaga
61 ggactccatt tagatcagca actgcaactt ctccccatgg actcatccaa gaagacagag
121 gtggttctcc tggcctgtgg ttcttttaac ccaatcacca acatgcacct caggctgttt
181 gagctggcca aggactatct gaacgctaca ggagaataca aagttatcaa aggcatcatc
241 tcaccagtcg gtgatgcata caagaagaaa ggactcatcc cagcccacca ccgaatcatc
301 atggcggaac ttgccaccaa gaattcacac tgggtggaag tagacacatg ggaaagcctt
361 cagaaggaat gggtggagac cgtgaaggtg ctcagacacc atcaggagaa gctggcaact
421 ggcagccgca gtcacccgca aagctcacct gtgctggaaa ggcctgggcg gaagaggaag
481 tgggctgatc aaaagcaaga ttctagccca cagaagcccc aagaacccaa accaacaggt
541 gtgcccaggg tgaaattgct gtgtggcgca gacttgctgg agtccttcag cgtccccaac
601 ttgtggaaga tggaggacat cacgcaaatc gtggccaact ttgggctcat ctgtgtcact
661 cgggctggca gtgacgctca gaaattcatc tacgagtccg acgtgctgtg gcgacaccag
721 agcaacatcc acctggtgac cgagtggatc accaatgaca tctcatccac caagatccgc
781 cgagcgctca ggaggggcca gagcatccgc tacttggtgc cggacctcgt ccaagagtac
841 attgaggagc atgatctgta caactctgag agcgaagacc ggaatgccgg ggtcaccctg
901 gcacctctac agaggaacac ctcggaggcc aaacacaacc attccacccg atgacacccc
961 gcaacgtccg atgatcctct ccaggcccaa aacaattggt gttagtaact cagggaagga
1021 cttgccatcc tgttttataa actgaaattt aaaggtttga ttaaaaaaac caacagggaa
1081 ttaagatcag ttactgagat gaatgttcta aataagacca tataagaaag aatgtaatac
1141 acctttaaaa taacagctca ttcactaaaa tgagatgtca atgatgccct ctctaaatac
1201 attttttcaa gaaaggaccc tgtgctgtgc tctaccacac aagaggccgg agacatagtt
1261 ccgaggttaa gagcacagac tgcccttcca gagcattcag attcagctcc cagcacctgc
1321 aaggcagctc acaactgtct gtaactccag tcccagggga tccgatgccc tctctgtccc
1381 ctatgggctg taggccacaa atggtgcata gacagacata caggcaaaag atacatacat
1441 acacacactc acagatacac gcacagatac acacagacac aaaaacacac acgcacagat
1501 acgcatacat acacatacat acacacacac atacacacat acatacatac acacatacac
1561 gtattcacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacaaag
1621 aagaacctca ctttaaccag actcagtgat ggccacctac agccccagct gcaccaggag
1681 ttgacgtagg agaatcactt tgaacccagg agtctgagat gactctagac aacatggacc
1741 ctttctgaaa acaaaaacaa aacagaatcc tagctctagt tatgaagaga gctgtccatg
1801 gctggcgccg gccatcttta tccagagtag aaggaaggaa ttctttacga cgtgaccttg
1861 gctgggcatg cagctcggtc ggtagagcat tggcccgcag gcccgaggcc ctgggttaga
1921 tccccagagc cacatcgact gggcacggca gtgcacacct gtgatcctgg cactcgggag
1981 attgaagcag aaggatcaaa agctcgaggt catccttgac aaccagcaag tttgaggccg
2041 tcaagagatg ccaaagaccc cttctctaaa ttaaacaaat aaataaatga ctctgtaaaa
2101 tgcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa
我设计的是：
Antisense TTGCCTGTATGTCTGTCTATGC
Sense GAGGACATCACGCAAATC

8黑眼圈8[使用道具]
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发表于 2011-10-19 12:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不用软件是可以,但不blast,可能是不行的. 如不blast,如何知道你的引物与其他序列有match?

Darcy[使用道具]
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发表于 2011-10-19 12:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也马上要做RT-PCR了，做的是RSV 干预A549细胞后细胞中IL-8、FKN、IKK、 IKB、NF-KB P65 、NF-KB P50的表达，但引物没有着落，哪位热心战友帮下忙吧

森林木[使用道具]
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发表于 2011-10-19 12:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教！望帮助！希望有经验的老师，师兄弟姐妹们赐教，谢谢！！！
我的实验：明确suPAR（可溶性尿激酶型纤溶酶原激活物受体）在疾病的发病中的作用，PCR方法和基因克隆手段构建suPAR的重组表达质粒DNA。
现在准备开始预实验，有几个问题没有解决：
1.作为PCR的suPAR基因模板最初可以从什么地方来，我看相关的文献多用半成品，如pTracer-uPA,或者从人脐静脉内皮细胞(HUVEC) 中克隆suPAR 基因，不知可以用肿瘤细胞嘛？如卵巢癌细胞3AO,肝癌细胞HepG2.
2.引物的设计，也是一个大问题。我看相关的文献，有不同的设计，但都可以在全序列中找到相对应的上游引物并包含起始密码；可是下游引物却不包含终止密码，这么做可以嘛？他们的文献可靠嘛？『1.可溶型尿激酶受体基因的表达及其对肿瘤生长的影响；2.Reduction of breast carcinoma tumor growth and lung colonization by overexpression of the soluble urokinase-type plasminogen activator receptor (CD87)』
3.文献上多用病毒为载体。可以用真核表达载体如PCDNA3.1(+)来构建质粒嘛？
谢谢！！！

qqq111[使用道具]
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发表于 2011-10-19 12:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

保守区不完全一致，会不会导致Ｐ出来的基因和目的基因不一致．

椰子叶子[使用道具]
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发表于 2011-10-19 12:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

呵呵，我们老板从来不用什么设计软件，自己对着序列设计，然后估算一下TM值，最后看看3‘端结合情况，往往效率很高！他不相信什么软件！我是服了！

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用软件，但是最后修改一下最后几个碱基，不会让软件指挥我，一样效率很高！
不否认有高手能完全依赖经验解决问题，但是不要夸大，毕竟修行成“老中医”不容易。摆正机器和人之间的关系就行了，软件是能帮助人更高效的完成任务。

椰子叶子[使用道具]
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发表于 2011-10-19 12:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

软件设计也好，人工设计也好，只要能P出来就是好的，这个世界上没有什么是绝对行的，也没有什么是绝对不行的，多失败几把不是坏事，我觉得至少从中可以学到很多东西。很多东西，口授的作用不大，可能有很多师兄师姐的，读研究生时，引物设计啥的都不会费什么事情，而这样恰恰会看轻这个过程，觉得引物设计没啥，如果你是做大事的人，这是细节，你可以不用考虑，但是如果你自己工作，而且工作就是这些，可能到时候就很郁闷了，但是如果自己在这上面吃了很多苦，后面作这方面的工作时就会很轻松了，至少不会像没有头的苍蝇，个中百味，别人是传授不来的。这也许就是我的一点感慨，希望能对新学者有用。

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发表于 2011-10-19 12:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也快要做PCR了，可是感觉什么都不懂！我已经在NCBI内查到了基因序列，可是一大篇，正如WX810510附件所示一样，我不知道应该看那部分才是我所需要的序列。那位高手可以告诉我，谢谢了！

windy+++[使用道具]
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发表于 2011-10-19 12:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

何去何从[使用道具]
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发表于 2011-10-19 12:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主能介绍几个目前国内做的比较好的引物合成的生物公司吗？
急！

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上海英骏引物合成是一流的。

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