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标题:【求助】聚丙烯酰胺凝胶电泳

caihong[使用道具]
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发表于 2016-3-3 11:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】聚丙烯酰胺凝胶电泳


想问一下，相隔十个bp的片断在聚丙烯酰胺凝胶电泳中好不好分离啊？有没有哪位做过这么小片段的分离。谢谢了。
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ujne[使用道具]
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发表于 2016-3-3 11:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
应该可以分离的，因为聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用来检测点突变和基因微卫星，都是对小片段异常的检测，分离10bp片段应该是可以的，但要注意选择合适的胶浓度和交联度，可以参考分子克隆书
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eor[使用道具]
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发表于 2016-3-3 11:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人认为，用普通聚丙烯酰胺凝胶电泳是分辨不出的，
1.双链DNA分子存在构象上的差异，其直链，环与超螺旋的迁移率有一定差别，在带型判定上会引起混淆
2.普通聚丙烯酰胺凝胶电泳的有效分辨率只有在凝胶浓度达到20%时，分辨率才能达到10bp，但此时的分辨范围只有10bp-100bp，恐怕不能达到实验要求。
建议使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，即加入8M尿素的聚丙烯酰胺凝胶，尿素可使DNA双链打开全部呈单链状态，消除了构象带来的干扰，分辨率最高可达1bp。
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junjie05[使用道具]
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发表于 2016-3-3 11:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问楼上的战友，用同样的样品（标准）做单链DNA的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳＆双链聚丙烯酰胺凝胶电泳，其结果一样吗？有什么差异吗？急！
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vtongli[使用道具]
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发表于 2016-3-3 11:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回楼主：
我做过相差这么大的片段，用非变性聚丙烯酰胺凝胶肯定没问题，具体用多大浓度，就看你的片段长度了，DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下:
DNA片段长度(核苷酸数) 丙烯酰胺(%)
1Kbp～700bp 3.5
700bp～500bp 5
500bp～200bp 8
200bp 12
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woshituzhu[使用道具]
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发表于 2016-3-3 11:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做了一个月了可以用非变性聚丙烯酰胺凝胶分开10bp的DNA片断。用的是12%浓度胶。电泳仪和电泳槽是美国amersham公司。marker是大连宝生物公司20bp梯度marker，范围是20-200bp。你的电泳片断在200bp以下应该可以分出。
电压是50v，时间是3h。胶为9cm长，20bp，40bp，60bp间隔约1.5cm。
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2016-3-3 11:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我最近也要做PAGE,我的目的片段在50－150bp，我也觉得选择非变性PAGE，浓度大约在8%－12%比较合适，但是我还有一个疑问：在分子克隆书 书上提及的关于染料溴酚蓝的迁移率是什么意思啊，对电泳分析结果有什么影响吗？谢谢指教
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leifengta[使用道具]
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发表于 2016-3-3 11:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

6%-12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶可分开4bp的片段，若是变性聚丙烯酰胺凝胶甚至可分开2bp的片段。现在很多法医实验室就是用PAGE胶银染方法进行4bp重复的STR等位基因分型。
另外一点就是电泳时间最好久一点，2~3小时，根据玻璃板的长度和电压而定。所以玻璃板最好要长点，30~40cm为佳。但象你只分开10bp片段，无需这么长，20cm左右就可以了。
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555444[使用道具]
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发表于 2016-3-3 11:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
觉得可以用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，我们法医物证教研室就用的浓度为6%交联度为4%的PAG，电泳槽是自制的，通过银染的方法进行STR基因分型，重复单位是4bp，效果很好啊。
关键是实验室的设备条件的差异，需要选择最合适的电泳条件。我们用的是恒流，当然也可以恒压电泳。
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u234[使用道具]
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 小中大

求助: 我的两个片段是750BP左右,它们相差十几个BP,我想分开这两个片段,并且想回收.请问我该用多大浓度的胶? 怎么回收?用银染可以回收吗?和用EB回收方法一样吗?
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