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标题:【求助】PCR目的条带颜色淡，二聚体亮怎么办呀？

caihong[使用道具]
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发表于 2016-3-3 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】PCR目的条带颜色淡，二聚体亮怎么办呀？


本人做PCR已经有一个月，有一次跑的电泳图最漂亮，目的基因和内参条带均很亮，二聚体基本没有。后来一直按照这个条件跑，但每次目的基因条带颜色都很淡，而二聚体很亮。尝试过增加模板DAN的量，效果不明显和不知应该如何调整。
我的反应体系如下：（生工的PCR扩增试剂盒）
sterilized 水:15.9ul
pcr buffer :2.5ul
dntp:2.5ul
mg2+:2ul
引物1：0.5ul
引物2：0.5ul
模板DAN:1ul
taq酶：0.1ul
退火温度：５５度，３０Ｓ
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memory[使用道具]
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发表于 2016-3-3 15:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

减少引物二聚体的方法
1. 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法；
2. 可能模板有问题；
3. 模板浓度过小，适当加大模板量；
4. Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；
5. 取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；
6. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性；
7. PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。
8. 增加循环数；
9. 降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）；
10. 若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在 20-25mmol/l没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。
11. 以上次的pcr产物作模板二次pcr，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍
PCR目的条带颜色淡:
为提高pcr产量，可尝试改善条件。
1 主要试着降低退火温度可提高pcr产量,以不产生非特异性调带为好.eg:52，5，53，54，55，56，57
2 提高Mg浓度（mM）可提高pcr产量,以不产生非特异性调带为好.eg：1.5，2.0，2.5，3,0。
3 增加模板量可提高pcr产量.
4 增加循环次数,eg:40cycler.
5 取原先PCR产物作为模板进行二次PCR.
6 换高效Taq酶.
祝:实验顺利!
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jkobn[使用道具]
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发表于 2016-3-3 15:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
简要地说，你的问题主要是：反转录效果不好，因为内参颜色就很淡嘛，这个是你目的条带很淡的主要原因。可以增加5-10个循环，或者用原来的PCR产物二次扩增，如果效果不好，考虑重新反转录。二聚体，主要是由于cDNA浓度过低，引物相对过多引起的，增加循环数比较好，也有可能是引物不特异产生的，可以换引物或者提高退火温度试试
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2016-3-3 15:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
减少引物二聚体的方法
1. 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法；
2. 可能模板有问题；
3. 模板浓度过小，适当加大模板量；
4. Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；
5. 取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；
6. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性；
7. PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。
8. 增加循环数；
9. 降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）；
10. 若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在 20-25mmol/l没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。
11. 以上次的pcr产物作模板二次pcr，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍
PCR目的条带颜色淡:
为提高pcr产量，可尝试改善条件。
1 主要试着降低退火温度可提高pcr产量,以不产生非特异性调带为好.eg:52，5，53，54，55，56，57
2 提高Mg浓度（mM）可提高pcr产量,以不产生非特异性调带为好.eg：1.5，2.0，2.5，3,0。
3 增加模板量可提高pcr产量.
4 增加循环次数,eg:40cycler.
5 取原先PCR产物作为模板进行二次PCR.
6 换高效Taq酶.
祝:实验顺利!
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caihong[使用道具]
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发表于 2016-3-3 15:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢楼上的。最近我加大模板量为2UL，却连目的基因的影子也不见了。后来又改回1UL。昨天和今天又做了几个模板，都加的1UL，内参颜色很淡，目的基因几乎看不到。不知道是什么原因，是不是模板有问题了。这几个模板测得的MRNA的OD值都在1.8-2.0之间,但是这几个模板逆转录时99度水浴时间>5分钟(说明书是要求5分钟)。而我以前的模板按照同样条件都能看到目的基因条带的。不知是不是这个原因了。
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发表于 2016-3-3 15:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
模板的问题:
不知道你提取的总RNA跑过电泳没有,如果没有,我觉得OD值的结果未必能真实反映RNA的质量,而这是最关键的,反转录时的试剂盒按标准操作估计问题不大,冰上操作,其中一些加温步逐后建议在冰上至少放置一分钟.效果可能更好.
引物特异性:
如果有其他的引物,可以试试换一对引物,引物本身花费不多,但是花费的时间和相应的试剂耗材就太不值得了
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caihong[使用道具]
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发表于 2016-3-3 15:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我今天重新抽提RNA和逆转录获得CDNA，提取RAN和逆转录的过程都很顺利。然后按照前面的反应条件进行PCR扩增，目的基因条带还是没有，而内参很清晰。这应该可以排除模板和试剂降解的因素。但到底是什么原因呢？难道是目的基因引物因反复冻溶降解了？那为什么内参引物没降解了？实在是捉摸不透。
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发表于 2016-3-3 15:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上所说的:5. 取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；
这点我看行不通吧?上下游引物可以混合在一起吗?
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caihong[使用道具]
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发表于 2016-3-3 15:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的退火温度是根据引物TM值设定的，并且用这个温度和同样的条件跑出过清晰的目的基因和内参条带，只是后来不知为什么就跑不出来了。
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eor[使用道具]
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发表于 2016-3-3 15:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1. 主要还是考虑你的目的基因引物是否有问题,可以重新合成.
2.不好意思说,你要考虑加样时是否操作正确.
3.楼上弦子" 这点我看行不通吧?上下游引物可以混合在一起吗? "
为什么不能混呢,本来体系都要混在一起的.
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