【求助】何谓touch down PCR?

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标题:【求助】何谓touch down PCR?

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发表于 2016-3-3 17:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谁能解释“touch down PCR"的具体内容？

moonlight[使用道具]
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发表于 2016-3-3 17:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Touchdown PCR involves decreasing the annealling temperature by 1 degree C every second cycle to a 'touchdown' annealing temp which is then used for 10 or so cycles. It was originally intended to bypass more complicated optimization processes for determining optimal annealing temperatures. The idea is that any differences in Tm between correct and incorrect annealing gives a 2-fold difference in product amount per cycle (4-fold per degree C). You therefore enrich for the correct product over any incorrect products.
Another use for this procedure is in determining DNA sequence for a known peptide sequence. The strategy here is to use two sets of degenerate primers that match potential coding sequences at the two ends of a peptide of known sequence. In practice, this requires that you know a stretch of peptide sequence of only 13 amino acids, with left and right primers of 18 nt (6 a.a.) and a space in between of one or more nt. Using these degenerate primers, you do a touchdown PCR. You will get a huge number of products, but you can select the desired product based on size since you know the exact interprimer distance from the peptide sequence. The advantage of this technique is that the touchdown PCR enriches for products containing correct matches between primers and template. If you clone and sequence a dozen PCR products, you can determine the correct coding sequence for the peptide, design an oligo for hybridization, etc. The technique is especially useful for peptide sequences full of ser, lys, and arg (six codons each).

moonlight[使用道具]
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发表于 2016-3-3 17:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

For more information see:
Don, R. H., P. T. Cox, B. J. Wainwright, K. Baker, J. S. Mattick. 1991. Touchdown PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Res. 19:4008-
转贴自cuturl('http://bip.weizmann.ac.il/mb/bioguide/pcr/PCRTouchdown.html')

45778[使用道具]
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发表于 2016-3-3 17:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Touch down(TD)PCR是一种特殊技术。采用它我们可以不需做预实验来进行条件选择，只需要做一次正式实验，就可能保证此次扩增试验在即使不是最佳也是在比较理想的条件下进行的，绝大多数情况下都可以获得理想的扩增效果。
其基本操作是：根据对引物Tm值的计算，确定一个退火温度的大范围（不是一个点，而是一个可以跨越10～20度的范围），计算的Tm值应落在这个范围中间。在做扩增周期程序设定时，让退火温度从选定范围的最高温度开始逐步降低温度，每次降低一度，最后结束在选定范围的最低温度处。在每一个停留温度上循环两次。这样，引物在某一较高温度下与模板复性并引发延伸合成产物，通常是特异性扩增产物，因为它是在最早也即Tm值较高的条件下引发合成的，在随后退火温度继续下降的过程中，上述的延伸合成会继续进行。可以想象，在退火温度下降过程中，很有可能引物还会在模板上找到第二个复性并引发延伸的部位，但是由于该位点是在更低的Tm值下与引物复性的，故通常是“假阳性扩增”。这两个产物在含量上有极大区别。如果特异性扩增带与假阳性带之间的Tm值相差3度，由于在每个温度上进行两次循环，故特异性较高的合成产物经过了6次循环后假阳性产物才开始合成，故特异性产物的量大于假阳性产物的64倍（26），两者在量上是不难区别的。TD PCR的缺点就是它的程序设定比较复杂，由于要用到一系列的变化的退火温度，故要占用PCR仪中的大量程序容量。

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发表于 2016-3-3 17:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

说得土点，是慢慢降低退火温度，从高到低，使得扩增的片断保证在前面几个循环中是特异的，到后面特异的模板比非特异的高，在后面的循环中间，非特异带竞争不过特异带。
一般是从70－60度，如果你的引物TM在65度以上，设计度要求是从开始的Tm+5(10) 到Tm-5(10),剃度温度到降低取决于PCR仪，大部分都可以做的到。

wiwi[使用道具]
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发表于 2016-3-3 17:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

“TD PCR的缺点就是它的程序设定比较复杂，由于要用到一系列的变化的退火温度，故要占用PCR仪中的大量程序容量。 ”胡说八道！
有几个人用老式PCR仪做降落PCR的，你用MJ的试试，程序设置和普通的PCR没有大差别的。

october7[使用道具]
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发表于 2016-3-3 17:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我同意楼上的说法，TDPCR的确在设置程序的时候需要输入多个循环，应该是比普通的PCR复杂的多，输入的字符多了自然会占用较多的PCR的程序容量的。

biabiade[使用道具]
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发表于 2016-3-3 17:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不好意思，问个很菜的问题，touch down PCR在普通的PCR机子上能跑吗？
还有一个问题就是，touch down PCR的效果与慢慢摸条件后PCR的结果相比怎么样？

woshituzhu[使用道具]
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发表于 2016-3-3 17:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我觉得touch down PCR在普通PCR仪上也是完全可以做的，只不过必须一个循环一个循环地设置反应参数，虽然步骤相对要烦琐一些但仍然可以达到相同的效果。

社会主义好[使用道具]
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发表于 2016-3-3 17:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我有个具体问题:我有一个400多BP的反转录模板,引物TM值60(61),一开始用56-54-52-58均拉不出来,后来分析序列中GC含量很高(70%),故提高TM至60,这次拉出来了,目的条带位置的模糊片断,分不太清,然后以此产物62度PCR,这次出来四条带,其中一条应为目的条带(和对照比位置一样)其它三条一条估计为引物二聚体,另两条只能是非特异了,然后我尝试将60度PCR的产物再作一次PCR,即应用touch down方法,提高特异性66-64-62,条带反而更弱了,还有四条,照理我提高退火温度,应该条带减少啊,,如何改进?清高人指点!万分感谢!!

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