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标题:[求助]关于GC含量高的问题

店小二[使用道具]
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发表于 2011-10-20 14:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
经过反复的摸索，我将循环增加到39个循环，退火温度经过反复的做剃度，同时改变反应体系，发现退火温度改变一度（在我合适的温度下），扩增结果就有很大的变化，不过不管怎么样还是有结果出来了，谢谢上面各位的支持！我想GC含量还没有达到80以上，如果有那么高一定就要想其它的办法了。。。。。。
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发表于 2011-10-20 14:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对于G＋C含量高的DNA序列，额外加入甘油，延长变性时间，应用核苷酸类似物可以提高PCR产量。希望对楼主有所帮助。
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发表于 2011-10-20 14:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对于G＋C含量高的DNA序列，额外加入甘油，延长变性时间，应用核苷酸类似物可以提高PCR产量。希望对楼主有所帮助。
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发表于 2011-10-20 14:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
于G＋C含量高的DNA序列，额外加入甘油，延长变性时间，应用核苷酸类似物可以提高PCR产量。希望对楼主有所帮助。

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加入甘油?量多少?
应用核苷酸类似物?能不能具体点,谢谢!!
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发表于 2011-10-20 14:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对于G＋C含量高的DNA序列，额外加入甘油，延长变性时间，应用核苷酸类似物可以提高PCR产量。希望对楼主有所帮助。

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加入甘油?量多少?
应用核苷酸类似物?能不能具体点,谢谢!!
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发表于 2011-10-20 14:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
引物GC含量分别高达74%与69%
对于G+C含量很高的可以加入甘油和二甲基亚砜(DMSO),添加量两者为2%~10%,本人扩增的目的片段G+C含量高达75%,加入甘油和二甲基亚砜(DMSO)后,目的条带很明显扩增出来,希望对楼主有所帮助.
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店小二[使用道具]
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发表于 2011-10-20 14:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大家的发言都让我受益匪浅，不过我觉得似乎有一个问题是不是有点混淆了，引物GC含量高和模板（或目的片段）GC含量高应该是两种情况吧?
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koook5695[使用道具]
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发表于 2011-10-20 14:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大家的发言都让我受益匪浅，不过我觉得似乎有一个问题是不是有点混淆了，引物GC含量高和模板（或目的片段）GC含量高应该是两种情况吧?

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第一轮反应的时候，模板是靶DNA本身，但是在后续的循环中，大量的模板是以引物开头结尾的，所以如果引物的GC含量高与模板的GC含量高的结果是相同的：模板难以打开。设想，如果引物的GC含量很高，而模板的GC含量很低，那么，情况是：两头难以打
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koook5695[使用道具]
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 小中大
大家的发言都让我受益匪浅，不过我觉得似乎有一个问题是不是有点混淆了，引物GC含量高和模板（或目的片段）GC含量高应该是两种情况吧?

================================================================================================================

第一轮反应的时候，模板是靶DNA本身，但是在后续的循环中，大量的模板是以引物开头结尾的，所以如果引物的GC含量高与模板的GC含量高的结果是相同的：模板难以打开。设想，如果引物的GC含量很高，而模板的GC含量很低，那么，情况是：两头难以打开，中间却已经打开了，反之，两头打开容易，中间打开较难，不过我这只是想象，没有试验依据。我倒是有一个问题想问：打开链的是达到某一特定温度的时候全部解链，还是在某一温度下，对应链中间的GC含量一定值的片段打开，达到一定值时，全部打开。然而Tm值的定义是以吸光度作为打开没有打开的依据的，并没有PCR试验的支持。
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