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标题:[求助]请教－PCR基础问题

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发表于 2011-10-20 15:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
同时还请教另一个问题：
在PCR参数中变性，退火及延伸时间如何确定？根据目的基因大小？如果时间过长是否会出现大量非特异性产物？
谢谢！  
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发表于 2011-10-20 15:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
同时还请教另一个问题：
在PCR参数中变性，退火及延伸时间如何确定？根据目的基因大小？如果时间过长是否会出现大量非特异性产物？
谢谢！  
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庄梦蝶[使用道具]
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发表于 2011-10-20 15:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你可以根据引物的OD值算出摩尔数啊。
33×OD/引物的分子量=摩尔数啊，再根据需要加水溶解就得到摩尔浓度啦。水是有体积的呀。我们一般稀释成两个浓度梯度。60μg/L和20μg/L两个浓度。在根据上面的公式算出就对啦。变性温度一般用的94或95，退火温度根据TM值来确定。比TM值低5左右。延伸温度用72度就可以。
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发表于 2011-10-20 15:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢楼上的兄弟：
我还是有点不懂，你说的33×OD，这个OD是否就是公司合成引物提供的清单上的μg/OD对应的那个值？引物的分子量是否安如下公式计算：
C×289+A×313+T×304+G×329
我问的第二个问题是指时间而非温度
谢谢
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发表于 2011-10-20 15:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢楼上的兄弟：
我还是有点不懂，你说的33×OD，这个OD是否就是公司合成引物提供的清单上的μg/OD对应的那个值？引物的分子量是否安如下公式计算：
C×289+A×313+T×304+G×329
我问的第二个问题是指时间而非温度
谢谢
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发表于 2011-10-20 15:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
基因组DNA做模板，每个反应1μg就够了

质粒做模板，1pg
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飞天小鹿[使用道具]
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发表于 2011-10-20 15:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
同时还请教另一个问题：
在PCR参数中变性，退火及延伸时间如何确定？根据目的基因大小？如果时间过长是否会出现大量非特异性产物？
谢谢！

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延伸时间根据目的片断大小，时间太长会使酶失活吧，我做 实验倒是好像没有出现过延伸时间长产生非特异性产物
退火是根据Tm值调整的
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雪花子[使用道具]
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发表于 2011-10-20 15:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
在PCR参数中变性，退火及延伸时间如何确定？根据目的基因大小？如果时间过长是否会出现大量非特异性产物？
谢谢！

PCR参数中变性要看你扩增目的基因中G+C含量，包括你的退火温度也是。延伸时间要看扩增目的基因片段大小，一般Taq酶每分钟大约扩增2000bp，因此延伸短可能会产生非特异性产物，而时间长可能性不大。退火温度可由电脑软件分析后推荐的Tm值上下调整几度。
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发表于 2011-10-20 15:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
比如公司提供的上下游引物的Activity(μg/OD) 分别是30和31.9，那么如何配储存液及在反应体系（50μl）选择应加的体积。
谢谢！  
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冰岛老叟[使用道具]
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发表于 2011-10-20 15:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
OD值和分子量都是引物序列上提供的值.  
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