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标题:[求助]PCR污染，原因不知道，请各位高手帮忙分析，谢谢

微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-10-21 13:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问你做pcr的时候是不是pcr样和对照样是一批做的？
如果是的话，有可能是pcr加样的操作过程中污染的。
做pcr时要戴一次性手套；保证枪头是一次性地使用（每加一次样要换枪头）；同一批的pcr样，加DNA模板时特别要注意避免污染，加样时动作尽量快一点，在加另一个样之前先把pcr反应管盖上，避免吸其他溶液时造成的污染。这样做一般都不会有污染的情况出现。如果还是污染，恐怕要重新设计引物了。
以上是个人的经验和意见，仅供参考。
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ha111[使用道具]
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发表于 2011-10-21 13:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢几位的分析，
阴性对照是分装完体系后，不加模板，也没有补加水
用的水是屈臣氏纯水，做其他的PCR也是一直用这种水，预先分装好，不过也有可能污染，
pcr样和对照样是一批做的
有戴手套，吸头绝对是一次性的
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ha111[使用道具]
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发表于 2011-10-21 13:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有没有可能是引物在合成的时候 就已经受到污染了？
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Darcy[使用道具]
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发表于 2011-10-21 13:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
本人在作研究生毕业论文时也曾经遇见这个问题，现在由于条件发生了变化，没有再出现这种情况。变化有以下几点，供你参考：1. 戴乳胶手套，模板最后加，加模板时注意打开盖子时污染手套；2. 使用的是带滤膜tip，这样就避免了污染枪尖。
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大桃子同学[使用道具]
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发表于 2011-10-21 13:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
主要考虑的问题就是摸板的污染，
1 你就单独做两管阴性对照，用不同的枪，看还能不能出来。用这种方法检测是不是你在加样时出了问题
2 如果还是出来，肯定就是你的水和你用的酶有了摸板污染了。如果出不来，那就是你的枪和加样时出了问题
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喵咪[使用道具]
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发表于 2011-10-21 13:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上说得有道理，
1你就单独做两管阴性对照，用不同的枪，看还能不能出来。用这种方法检测是不是你在加样时出了问题
2 如果还是出来，肯定就是你的水和你用的酶有了摸板污染了。如果出不来，那就是你的枪和加样时出了问题
我想补充一下，应考虑气溶胶污染
1.试剂打开前，最后短暂离心，打开时动作要轻；
2.有条件应用活塞式的微量移液器，可以防止加样时的气溶胶污染；
3.我以前做PCR时，反应循环太多（>35）阴性对照也会出现条带，不过远没有你的漂亮！！！
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mod=8048[使用道具]
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发表于 2011-10-21 13:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
从楼主的描述来看污染原因可基本排除基因组DNA的交叉污染所导致的假阳性。我不知道你在加样时是不是在超净台中进行，否则空气中的小片段核酸会致污染，导致假阳性的产生。
另外，你目前找了各种原因也没结果，我建议你还是重新设计，合成引物试试。  
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duoduo[使用道具]
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发表于 2011-10-21 13:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我怎么从来没有污染过阿

倒是实验室其他人经常的污染

就像我们实验室一个家伙养细胞养一种活一种也没有什么特殊的，可是交给我们其他人一下子就死了，大家不得不佩服

找个人帮你做算了，出了模板全部换掉

气溶胶什么地很玄不要过分考虑
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nut6694[使用道具]
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发表于 2011-10-21 13:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得应该与引物没有什么关系吧

看样子是由于污染，就是不知道污染源是什么
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birdfish[使用道具]
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发表于 2011-10-21 13:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
本人一点小小的经验，仅供参考。

我前一阵子做PCR也总是有污染带也很亮，跟你的差不多，因为我的引物是细菌的通用引物，所以最后怀疑是引物太通用了，把水中的细菌也扩出来了。于是换用promega公司的去离子水，并经过滤高压，然后先做对照管，再做样品管，结果就非常棒，没有了污染带。

不知你的引物是否跟我的存在相似的问题，以上仅供参考。
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