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标题:[求助]PCR污染，原因不知道，请各位高手帮忙分析，谢谢

vivian4123[使用道具]
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发表于 2011-10-21 13:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
本人一点小小的经验，仅供参考。

我前一阵子做PCR也总是有污染带也很亮，跟你的差不多，因为我的引物是细菌的通用引物，所以最后怀疑是引物太通用了，把水中的细菌也扩出来了。于是换用promega公司的去离子水，并经过滤高压，然后先做对照管，再做样品管，结果就非常棒，没有了污染带。

不知你的引物是否跟我的存在相似的问题，以上仅供参考。

========================================

ddH2O水里面也有细菌么？而且还经过高温高压灭菌
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发表于 2011-10-21 13:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也说不好，当时有老师提出说考虑是水的问题，建议我用去离子水，于是试了一下居然就好了。不过那个课题我也就做到那停下了。我不知道咱们平时用的那种ddH2O里边是不是会有菌呢？就像咱们平时的饮用水，其实不是完全无菌，而只是菌量在一定的标准以下。不知各位仁兄对此有何见解？我也很想知道个中原因，请指教！
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发表于 2011-10-21 13:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也说不好，当时有老师提出说考虑是水的问题，建议我用去离子水，于是试了一下居然就好了。不过那个课题我也就做到那停下了。我不知道咱们平时用的那种ddH2O里边是不是会有菌呢？就像咱们平时的饮用水，其实不是完全无菌，而只是菌量在一定的标准以下。不知各位仁兄对此有何见解？我也很想知道个中原因，请指教！
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发表于 2011-10-21 13:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
从楼主的描述来看污染原因可基本排除基因组DNA的交叉污染所导致的假阳性。我不知道你在加样时是不是在超净台中进行，否则空气中的小片段核酸会致污染，导致假阳性的产生。
另外，你目前找了各种原因也没结果，我建议你还是重新设计，合成引物试试。

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最后两次就是在超净台里面加的样

我想问一下，再合成引物的话，是不是另外设计序列？可以拿原来的序列重新合成吗？
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发表于 2011-10-21 13:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
本人一点小小的经验，仅供参考。

我前一阵子做PCR也总是有污染带也很亮，跟你的差不多，因为我的引物是细菌的通用引物，所以最后怀疑是引物太通用了，把水中的细菌也扩出来了。于是换用promega公司的去离子水，并经过滤高压，然后先做对照管，再做样品管，结果就非常棒，没有了污染带。

不知你的引物是否跟我的存在相似的问题，以上仅供参考。

========================================================================================

这对引物是扩增人类基因组DNA的，做BLAST特异性很强的，不过可以考虑水的问题，可能是这对引物效率太高了  
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发表于 2011-10-21 13:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
哦。我当年的引物是用于扩增细菌的。  
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发表于 2011-10-21 13:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们实验室的师姐原来也遇过同样问题，所有污染源的可能都查到了，还是不行，单最后用酒精擦了擦PCR仪，搞定，试试吧，但愿你是幸运的。
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发表于 2011-10-21 13:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
昨天把引物拿到学校另外一个实验室让别人做了一次
真是神奇了，阴性对照没有出现阳性，条带的大小也改变了，
什么原因呀？


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发表于 2011-10-21 13:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
补充两点：
1.先把阴性对照的水加好盖上后再打开摸板
2.PCR之前将枪，dNTP，水，缓冲液放超净台用紫外线照射20-30分钟  
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#甜#[使用道具]
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发表于 2011-10-21 13:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
昨天把引物拿到学校另外一个实验室让别人做了一次
真是神奇了，阴性对照没有出现阳性，条带的大小也改变了，
什么原因呀？

===============================

那说明以前的都是假阳性

奇怪，没有想出是什么造成污染的么？？
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