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标题:【求助】蛋白表达分子量偏大

大嘴猴[使用道具]
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发表于 2016-3-21 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

Mass, 也就是质谱测分子量。
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xiaoxiaojinglin[使用道具]
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发表于 2016-3-21 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 添加 xiaoxiaojinglin 为MSN好友 通过MSN和 xiaoxiaojinglin 交谈

 小中大

【回复】

1.如果你是在动物细胞里表达重组蛋白，因为翻译后修饰的存在（如磷酸化、乙酰化、泛素化等），蛋白比预测大一点比较正常，如果特别纠结，加一个原核表达的蛋白作为对照（去除标签）
2. 也有一些跟预测大小差别比较大的情况，如人的SIRT1，预测82kd左右，western Blot检测癌细胞一般接近120kd
所以建议你参考你研究蛋白的文献、抗体公司提供的datasheet，综合考量分析原因。
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发表于 2016-3-21 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

你的蛋白是不是糖蛋白？如果是糖蛋白，糖基化修饰会造成蛋白分子量比根据氨基酸预测分子量大
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qinqinai[使用道具]
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发表于 2016-3-21 11:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

理论值70kD，在胶上120kD肯定不正常的；37kD，在胶上40多kD还是可以接受的。要想确定是不是你的蛋白，最好一下肽谱鉴定。
提醒一下楼主注意克隆时终止密码子问题
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大大[使用道具]
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发表于 2016-3-21 11:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

mass spectrum，通过质谱确定精确的分子量，但是对于确认一个蛋白是不是你的目标蛋白，证据并不充分。因为你在表达纯化中可能存在降解、截短等，因此还是建议你通过质谱做一下肽指纹来鉴定
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发表于 2016-3-21 11:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 QQ

 小中大

【回复】

不是分别跑的，是在同一块胶上的，但是我分开跑的时候也是偏大的
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发表于 2016-3-21 11:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

我是做过WB 的 有条带，所以应该就是我的目的条带，现在只是偏大的问题 还有就是我老师说要我做变性电泳，可是我现在做的SDS-PAGE就是啊，还有别热什么方法使蛋白质变性么？
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钻石[使用道具]
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发表于 2016-3-21 11:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

不是糖蛋白呀，而且我是在大肠杆菌中表达的，是原核表达系统，一般不会形成糖基化吧
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mimima[使用道具]
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发表于 2016-3-21 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

楼主过表达的质粒上是否带有融合标签？如果有的话试着检测一下标签看看
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wawa11[使用道具]
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发表于 2016-3-21 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【回复】

你用质谱测定一下样品蛋白质的分子量，这应该是准确的。SDS-PAGE有时与胶或者蛋白质的形状有关，有时候测定的不太准确。
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